检测志贺氏氏菌环介导恒温扩增试验引物组及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种恒温环介导试验检测志贺氏菌的引物组，内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，检测方法包括以下步骤：首先提取待测菌的基因组DNA，再以提取的基因组DNA为模板进行LAMP扩增，然后对扩增产物进行检测，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌，试剂盒包括还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4和Betaine，所述快速检测志贺氏菌的LAMP引物组具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。

Primer group and its application for detecting Shika Jiji ring mediated constant temperature amplification test

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to a primer set for loop mediated isothermal test for the detection of Shigella, outer primers and inner primers FIP/BIP F3/B3 detection method includes the following steps: firstly, extracting genomic DNA of tested bacteria, the extracted genome DNA as template for LAMP amplification, and then tested for PCR products, by judging whether the reaction results were tested to determine whether the presence of Shigella in the sample, including the kit also includes a Bst DNA polymerase buffer, Bst, dNTPs, MgSO4 DNA polymerase and Betaine, the LAMP primer set for rapid detection of Shigella and has high sensitivity and specificity. Short detection time, simple result, convenient operation, low cost.

【技术实现步骤摘要】
检测志贺氏氏菌环介导恒温扩增试验引物组及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种恒温环介导试验检测志贺氏菌的引物组。
技术介绍
志贺氏菌（Shigella）是一种在世界范围内广泛流行的人畜共患病的病原菌，主要引起人和动物急性肠炎。志贺氏菌是发达国家最常见的腹泻病病原菌之一，是受到高度关注的人畜共患病病原，国际兽疫组织（OIE）规定实验猴贸易必检项目。我国志贺氏菌检验当前采用的方法是传统分离培养-生化鉴定法，志贺氏菌培养过程中大量杂菌会把目的菌落覆盖，较难找出典型菌落,所以该方法检出率低，工作强度大，检出率低。随着新技术的出现，有必要开发出一套准确快速的检测方法，辅助或代替现行的志贺氏菌检测方法，以适应技术进步新要求。环介导等温扩增（LAMP）技术优点是一是设备简单，只需要水浴锅温育即可，不需要复杂或贵重仪器。二是快速高效，核酸扩增在l小时内即可完成。三是特异性高，要求4种特异性引物，引物不匹配不能进行核酸扩增。四是高灵敏度，荧光PCR的灵敏度相当，比PCR高10～100倍。五是成本低廉，特别适合现场检疫和基层单位如防疫站检疫或养殖场检疫。LAMP技术的核心要素是引物，引物的优劣决定着各种形式LAMP试验性能，LAMP引物共有内引物对和外引物对4条，设计要求较高，要求引物组对靶DNA扩增性能好，对志贺氏菌特异性反应，还要求4条引物之间或自身不能发生退火情况发生，否则容易产生假阳性。但扩增效率高、特异性强、无假阳性LAMP引物的设计成功率不高，需要从大量的引物中去测试，最后选择出符合要求的引物组。所以志贺氏菌LAMP引物组是经过实践检验的科研成果，对志贺氏菌检验有较高的应用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别志贺氏菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本专利技术基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源（截至2013年8月5日数据）进行志贺氏菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测志贺氏菌的方法、引物组及试剂盒。本专利技术的一个目的在于提供2组引物，各含1对上下游内引物和1对上下游外引物，引物DNA序列信息如下：引物组A：上游外引物F3_A：5’-GAAGAGCATGCCAACACCT-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-TCCTCACAGCTCTCAGTGG-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-CGGAATCCGGAGGTATTGCGT-TTTCCGCGTTCCTTGACC-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-CGCTGCATGGCTGGAAAAACTC-GCAGCAACAGCGAAAGACT-3’(SEQIDNO：4)；引物组B：上游外引物F3_B：5’-GGTCATTTGCTGTCACTCC-3’(SEQIDNO：5)；下游外引物B3_B：5’-CTGGGCAGGGAAATGTTC-3’(SEQIDNO：6)；上游内引物FIP_B：5’-GCTCGCAGAGAAACTTCAGCT-CGACACGCCATAGAAACG-3’(SEQIDNO：7)；下游内引物BIP_B：5’-TGGTCTGGAAGGCCAGGTAG-CATTGCCCGGGATAAAGTC-3’(SEQIDNO：8)。本专利技术的另一个目的在于，提供一种检测志贺氏菌的试剂盒，包括能检测志贺氏菌的基因组特异碱基序列的环介导恒温扩增试验引物组，还包括BstDNA聚合酶缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs、MgSO4和Betaine；本专利技术的另一个目的在于，提供了一种志贺氏菌的方法，包括以下步骤：（1）提取待测菌的基因组DNA；（2）以提取的基因组DNA为模板，使用本专利技术的引物组进行环介导恒温扩增；（3）对扩增产物进行检测，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌；其中，所述LAMP扩增的反应程序为：（1）90~98℃热水浴0.5~3min；（2）50℃水浴反应0.5~3min;（3）63℃水浴反应0.5~2h；（4）80℃水浴终止反应1~8min；进一步的，所述LAMP扩增反应体系中MgSO4的终浓度为2.5~5mM/L，dNTPs的终浓度为1mM~4mM/L，F3和B3引物的终浓度为0.05μM/L~0.5μM/L，FIP和BIP引物的终浓度为0.5~1μM/L，BstDNA聚合酶的终浓度为0.2~2U/μL，Betaine的终浓度为0.5~3M/L；进一步的，所述LAMP扩增反应体系中MgSO4的终浓度为3.2mM/L，dNTPs的终浓度为1.4mM/L，F3和B3引物的终浓度为0.08μM/L，FIP和BIP引物的终浓度为0.64μM/L，BstDNA聚合酶的终浓度为0.32U/μL，Betaine的终浓度为0.8M/L。本专利技术快速检测志贺氏菌的方法包括但不限于，电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测优选为凝胶电泳检测法，电泳检测结果中，如电泳图呈特征性梯状条带，则待测样品呈志贺氏菌阳性，含有志贺氏菌；如电泳图不呈特征性梯状条带，则待测样品呈志贺氏菌阴性。所述浊度检测，是肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现明显浑浊，则待测样品呈志贺氏菌阳性，含有志贺氏菌；如未见浑浊，则待测样品为志贺氏菌阴性。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈志贺氏菌阳性，含有志贺氏菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈志贺氏菌阴性。所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限定羟基萘酚兰，反应后颜色为蓝紫色，则待测样品为志贺氏菌阴性；如反应颜色为蓝绿色，则待测样品为志贺氏菌阳性。本专利技术的有益效果为：本专利技术为食品安全检测技术、疾病诊断、动物检疫等领域提供了一种简单快速灵敏的检测志贺氏菌的引物组，具有较大意义。本专利技术引物组可应用于各种形式的环介导恒温扩增检测志贺氏菌DNA试验，引物组具有灵敏度高、特异性强等优点，可获得103cfu/mL（相当于6cfu/反应）的敏感度，引物组仅对志贺氏菌DNA反应，对常见肠道细菌无反应。操作简便、可重复性强，具有很好的实用性等优点。采用本专利技术的引物组检测志贺氏菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。附图说明图1、引物组A、B扩增产物酶切物电泳图，泳道1是DNA分子量标准，泳道2、3分别是引物组A、B扩增产物酶切物，泳道4是空白对照。图2、引物组A扩增产物酶切基因片段基因测序图。图3、引物组B扩增产物酶切基因片段基因测序图。图4、LAMP扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M是DNA分子量标准、泳道1~7是志贺氏菌的浓度梯度稀释液，其浓度分别为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、101cfu/mL、泳道N为阴性对照；图5、LAMP反应产物沉淀图，从左到右管中志贺氏菌浓度分别为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测志贺氏菌环介导恒温扩增试验引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列分别如下所示：引物组A：上游外引物F3_A：5’‑ gaagagcatg ccaacacct‑3’(SEQ ID NO：1)；下游外引物B3_A：5’‑ tcctcacagc tctcagtgg‑3’(SEQ ID NO：2)；上游内引物FIP_A：5’‑ cggaatccgg aggtattgcg ttttccgcgt tccttgacc ‑3’(SEQ ID NO：3)；下游内引物BIP_A：5’‑ cgctgcatgg ctggaaaaac tcgcagcaac agcgaaagac t ‑3’(SEQ ID NO：4)；引物组B：上游外引物F3_B：5’‑ ggtcatttgc tgtcactcc‑3’(SEQ ID NO：5)；下游外引物B3_B：5’‑ ctgggcaggg aaatgttc‑3’(SEQ ID NO：6)；上游内引物FIP_B：5’‑ gctcgcagag aaacttcagc tcgacacgcc atagaaacg‑3’(SEQ ID NO：7)；下游内引物BIP_B：5’‑ tggtctggaa ggccaggtag cattgcccgg gataaagtc‑3’(SEQ ID NO：8)。...

【技术特征摘要】
1.检测志贺氏菌环介导恒温扩增试验引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列分别如下所示：引物组A：上游外引物F3_A：5’-gaagagcatgccaacacct-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-tcctcacagctctcagtgg-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-cggaatccggaggtattgcgttttccgcgttccttgacc-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-cgctgcatggctggaaaaactcgcagcaacagcgaaagact-3’(SEQIDNO：4)；引物组B：上游外引物F3_B：5’-ggtcatttgctgtcactcc-3’(SEQIDNO：5)；下游外引物B3_B：5’-ctgggcagggaaatgttc-3’(SEQIDNO：6)；上游内引物FIP_B：5’-gctcgcagagaaacttcagctcgacacgccatagaaacg-3’(SEQIDNO：7)；下游内引物BIP_B：5’-tggtctggaaggccaggtagcattgcccgggataaagtc-3’(SEQIDNO：8)。2.一种检测志贺氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物组。...

【专利技术属性】
技术研发人员：温和心，龙英全，蒋荣华，
申请(专利权)人：温和心，
类型：发明
国别省市：广西,45