耐氨性的L（+）-产乳酸菌及生产L（+）-乳酸的方法技术

提供一种新的属于根霉菌属、具有耐氨性的Ｌ（＋）－产乳酸菌，以及使用其高收率地制备Ｌ（＋）－乳酸的方法。优选使用用亚硝基胍使根霉ＭＫ９６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６）变异得到的具有耐氨性的Ｌ（＋）－产乳酸菌，特别是根霉ＭＫ９６－１１５６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６－１１５６）菌株。可以通过在有氧条件下培养上述菌株生产Ｌ（＋）－乳酸，优选通过加入氨调整培养液的ｐＨ值。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及属于根霉菌属的、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌及使用该菌种生产L(+)-乳酸的方法，更详细的说是涉及用亚硝基胍使作为母株的根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)变异得到的具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，也就是说，涉及根霉MK96-1156本身及用它们在有氧的条件下以氨气作为中和剂调节培养液的pH，从而高收率地制备L(+)-乳酸的方法。乳酸可以作为食品添加剂用于酒类、清凉饮料、咸菜、酱油、面包、啤酒等的制备中，此外，在皮革、纤维、塑料等工业中也被利用，是一种有用的化合物。目前，用发酵法生产乳酸，一般是将属于裂殖菌类的乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)等被称作乳酸菌类的菌在无氧的条件下培养，进行乳酸发酵。乳酸菌的培养过程中使用的培养基是以糖、淀粉等作为主原料，并向其中添加作为副原料的酵母提取物等营养源。利用这些乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)等菌进行的乳酸发酵具有过程简单，且乳酸收率高的优点，但是一般来说，因为酵母提取物等副原料的价格高，所以得到的L(+)-乳酸的价格也就高。另外，由于这些菌的大小均为1μm以下，与培养基的分离比较困难，培养处理的操作性差。另一方面，也有使用根霉菌属类的丝状菌在含有碳酸钙的培养液中通过有氧培养生产乳酸的方法。从糖得到乳酸的收率在70-80％，由于葡萄糖等单糖能够作为碳源，而且培养基的成份除糖以外只要求少量的无机盐，所以发酵后培养基中的杂质比较少。例如，Kristofikova等(L.Kristofikova，M.Rosenberg，，A.Valnove，J.Sajbidor及M.Certik Folia Microbiol，36(5)，451-455(1991))以葡萄糖作为碳源，由无根根霉CCM8109(Rhizopusarrhizus CCM8109)生产79克/升乳酸。另外，也有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzae NRRL395)菌体生产乳酸的方法。例如，Yang等(C.W.Yang，，Zhongjing Lu及Geroge T.Tsaso；ApplidBiochemistry and Biotechology vol.51/52 p57-71，1995)描述的方法是在有氧的条件下，用添加了碳酸钙的培养液培养该菌体，得到收率为78％的乳酸。另外，上述根霉菌属的菌体容易形成聚集体(粒状沉淀)，由于能够简单的与培养基分离，所以容易从发酵后的培养基中分离纯化乳酸和该粒状沉淀。利用了这种粒状沉淀的优点的方法，有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzaeNRRL395)，在以木糖作为碳源的培养液中使之形成菌体粒状沉淀，用该粒状沉淀由葡萄糖生产乳酸的方法。例如，Soccol等(C.R.Soccol，B.Marin，M..Raimbault；Appl Microbiol Biotechnol 41，286-290(1991))在有氧的条件下，在含有中和剂碳酸钙的培养液中发酵培养得到的菌体粒状沉淀，得到收率约为75％的乳酸。采用这种方法，在含有碳酸钙的培养液中培养该粒状沉淀，通过每次消耗完作为碳源的葡萄糖后再在新的培养液中培养，可以连续的生产乳酸。这样，在有氧的条件下培养根霉菌属的菌株，以葡萄糖和淀粉为原料生产L(+)-乳酸时，与使用乳酸菌的场合相比，具有多种优点。但是，在有氧的条件下培养根霉菌，产生乳酸的收率一般比较低，而且发酵大多需要7-10天，生产乳酸的时间长。因此，与使用乳酸菌在无氧条件下的发酵比较，缺乏工业实用性。另外，虽然上述Soccol等也报告了再次使用根霉菌的连续培养，但是使用该菌株时，3次以后乳酸的产量大大降低，为了防止这种事情的发生，就必须向培养液中添加尿素作为氮源。另外，一般的采用产乳酸菌生产L(+)乳酸的方法中，为了抑制产生的L(+)-乳酸阻碍产物的产生，而且为了中和培养液的酸度，必须使用碳酸钙及氢氧化钠作为中和剂中和L(+)-乳酸。以高收率得到乳酸时，目前已知的用根霉菌属进行乳酸发酵所使用的中和剂几乎都是碳酸钙，为了从生成的乳酸钙中分离纯化乳酸，除了使用添加硫酸分离硫酸钙沉淀的方法以外没有其它方法，由于生成大量副产物硫酸钙，在工业上也是一个问题。某些时候使用氨气作为中和剂得到乳酸铵时，由于氨气阻碍了菌体的活性，所以很容易在收率及生产性方面出现不理想的情况。而且，上述Soccol等指出，不使用碳酸钙等作为生成的酸的中和剂，而是用聚4-乙烯吡咯烷酮(PVP)树脂吸附分离L(+)-乳酸，由于细胞收到损伤而存在产量降低的问题。另外，可以由含有多糖的糖类在菌体内各种酶的作用下产生乳酸，如果使用的菌株本身营养要求复杂，就必须在培养液中加入各种成份，这样从培养液中分离产乳酸菌产生的乳酸就比较困难，不容易制备收率好、纯度高的乳酸。另外，由于培养条件生成了副产物，为了乳酸纯化阶段的操作简便，就必须选择副产物生成少的培养条件。另一方面，为了高效率的使用菌体，优选再次使用产乳酸菌，但是一般如果再次使用菌株则难以完全满足其营养要求，生成乳酸能力低下的场合比较多。因此，必须选择再次使用性强的菌株。本专利技术鉴于上述课题，提供了一种使用亚硝基胍使根霉MK96(Rhizopussp.MK96)变异得到具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌。另外，还提供一种根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)的菌株。另外，还提供一种在有氧条件下培养上述菌株生产L(+)-乳酸的方法。另外，还提供一种根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)。本专利技术中，只要是属于根霉菌属、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，就可以使用。属于根霉菌属的、具有乳酸发酵能力的微生物，例如可以举出无根根霉(Rhizopus arrhizus)、德列马根霉(Rhizopus delemar)、爪哇根霉(Rhizopusjavanic)、变黑色根霉(Rhizopus nigricans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)等，其中优选米根霉(Rhizopus oryzae)或无根根霉(Rhizopus arrhizus)，L(+)-乳酸生成的能力高。这是因为这些属于根霉菌属、具有乳酸发酵能力的菌类能够呈颗粒状、块状培养。本专利技术中使用的L(+)-产乳酸菌，还必须具有耐氨性。作为这样的菌株，有本专利技术者们采用下述方法使从土壤中新分离出的母株根霉MK96(Rhizopussp.MK96)突变得到的变异株根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)。也就是说，本专利技术者为了解决上述问题，以得到具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌为目的，从自然界新分离出可以生成L(+)-乳酸的根霉菌属的菌体，经变异处理使之具有耐氨性，从而得到具有较高L(+)-乳酸生成能力的菌株。因此，即使使用氨气作为中和剂的时候，也能够产生L(+)-乳酸，并且不会导致收率降低。(1)母株的第1次筛选从水田土壤中取样品1g，用5ml灭菌蒸馏水使之悬浊，调制成样品原液。将其适当稀释得到的最终稀释液用康拉迪氏(コンラ-ジ)棒分别取0本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用亚硝基胍使根霉ＭＫ９６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６）变异得到的具有耐氨性的Ｌ（＋）－产乳酸菌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈部满康，
申请(专利权)人：株式会社武藏野化学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]