编码黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的D-赤糖酸4-磷酸-脱氢酶PDXR的DNA和维生素B*的微生物生产制造技术

本发明专利技术涉及一种来源于苜蓿中华根瘤菌的、编码与维生素Ｂ↓［６］的生物合成相关的新的黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）依赖的Ｄ－赤糖酸４－磷酸（ＥＮ４Ｐ）脱氢酶，和一种用含有该ＤＮＡ的载体转化的重组微生物。还涉及利用该重组微生物生产维生素Ｂ↓［６］的方法。本发明专利技术中使用“维生素Ｂ↓［６］”包括吡哆醇（ＰＮ）、吡哆醛和吡哆胺。维生素Ｂ↓［６］是人类或其他动物所必不可缺的维生素，被用作药物的原料或食物添加剂。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium melioti)的、编码与维生素B6的生物合成相关的新的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的D-赤糖酸4-磷酸(EN4P)(flavin adenine dinucleotide-dependent D-erythronate4-phosphate)脱氢酶的DNA，和一种用含有该DNA的载体转化的重组微生物。还涉及利用该重组微生物生产维生素B6的方法。本专利技术中使用的“维生素B6”包括吡哆醇(PN)、吡哆醛和吡哆胺。维生素B6是人类或其他动物所必不可缺的维生素，被用作药物的原料或食物添加剂。使用中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的苜蓿中华根瘤菌进行维生素B6的发酵生产已有记载(EP 765,938)。但是在利用微生物制备维生素B6的过程中维生素B6的生产效率不够高，需要构建具有更高的维生素B6生产能力的新微生物。在大肠杆菌中的4-PHT途径如下4-PHT合成起始于D-赤藓糖4-磷酸(E4P)，由E4P脱氢酶将其氧化为EN4P，进一步由EN4P脱氢酶氧化为2-酮基-EN4P，由转氨酶转氨形成4-PHT。这三个酶，E4P脱氢酶、EN4P脱氢酶和氨基转移酶，由三个基因编码，分别名为epd、pdxB和serC，对需要NAD+作为辅酶进行酶反应的大肠杆菌EN4P脱氢酶仅有一篇报导。另一方面，在苜蓿中华根瘤菌中4-PHT是从甘氨酸和羟基乙醛合成的。但是与这个反应相关的基因仍然没有被鉴定出来。为了鉴定这一基因，我们获得了一个在形成4-PHT方面有缺陷的维生素B6缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。并且我们获得了一个基因，命名为pdxR，其能补足该维生素B6缺陷突变株，我们发现pdxR编码一个新的FAD依赖的EN4P脱氢酶。根据本专利技术，通过利用具有包括含有pdxR的载体的重组质粒的中华根瘤菌属微生物进行发酵，有可能极大地提高维生素B6的生产效率。通过培养所述微生物可以方便地在培养液中生产维生素B6，并能以期望的纯度回收维生素B6。本专利技术提供了编码来源于中华根瘤菌属的FAD依赖的EN4P脱氢酶的DNA；携带含有编码该EN4P脱氢酶的DNA的DNA的表达载体；携带该表达载体的转化的宿主细胞；在该宿主细胞中产生的具有FAD依赖的EN4P脱氢酶活性的多肽；和利用该宿主细胞生产维生素B6的过程。除非另作说明，本专利技术中所使用的全部科学和技术术语都具有本领域通用的含义。本专利技术是以定名为pdxR的基因的发现以及利用该基因改善维生素B6的生产为基础的，pdxR基因编码FAD依赖的EN4P脱氢酶，该FAD依赖的EN4P脱氢酶与苜蓿中华根瘤菌的维生素B6生物合成有关。在本专利技术的验证过程中，我们发现了一个基因，名为pdxR，其补足了维生素B6缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)，该突变株的生长需要4-羟基-L-苏氨酸(在下文中称为4-HT)或维生素B6。pdxR与任何已公开的与大肠杆菌的维生素B6生物合成有关的基因都没有同源性。通过对苜蓿中华根瘤菌菌株1021的基因组数据库的检索，pdxR的推测的氨基酸序列暗示PdxR是一种诸如脱氢酶、还原酶和氧化酶的氧化还原酶。但是很难预测PdxR的底物。已发现的是pdxR基因不仅能补足维生素B6缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782，还能补足缺乏EN4P脱氢酶的大肠杆菌pdxB-突变株。这些发现表明PdxR与苜蓿中华根瘤菌中维生素B6生物合成的4-PHT途径有关，并且pdxR编码催化EN4P氧化成2-酮基-EN4P的氧化还原酶。通过进一步的实验，发现本专利技术中苜蓿中华根瘤菌的pdxR基因编码的基因产物包含FAD并且利用电子受体催化EN4P的氧化，这些电子受体诸如细胞色素c、2，6-二氯酚吲哚酚(2，6-dichlorophenolindophenol)(DCIP)、或铁氰化物，但不是O2，NAD+或NADP+。证据表明pdxR基因产物是一种有电子受体的脱氢酶而不是氧化酶，并且与大肠杆菌的有NAD+的EN4P脱氢酶完全不同。本专利技术涉及包括编码PdxR的DNA序列的DNA序列，其中PdxR是一种与维生素B6的合成有关的FAD依赖的EN4P脱氢酶，编码PdxR的DNA序列公开于序列表中，还涉及它们的互补链，或包括这些序列的DNA序列，与这些序列及其片段杂交、优选的在标准条件下杂交的DNA序列，和由于遗传密码的简并性、在标准条件下不与这些序列杂交但编码具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。杂交的“标准条件”在本文中是指本领域的技术人员通常使用的、用以检测特定的杂交信号的条件，或优选的是指所谓的严紧杂交和非严紧洗脱条件，或更加优选的是指所谓的中度严紧条件，或进一步优选的是指所谓的严紧杂交和严紧洗脱条件。例如，2×SSC和0.5％ SDS在45℃杂交1小时、0.1×SSC和0.5％ SDS在60℃洗脱1小时的条件。本专利技术还包括与SED ID NO1的DNA序列或其片段具有至少80％到85％，优选的至少86％到90％，更优选的至少91％到95％，特别优选的超过95％的同一性的DNA序列。本专利技术还涉及具有FAD依赖的EN4P脱氢酶活性的多肽，其是本案的多肽的功能性衍生物。这种功能性衍生物定义为根据本专利技术的氨基酸序列，通过添加、插入、删除和/或替换所述序列的一个或多个氨基酸残基，同时仍然具有所述FAD依赖的EN4P脱氢酶的活性的衍生物。这种功能性衍生物既可以通过已知的化学合成多肽法，也可以通过目前已知的方法、根据本专利技术公开的DNA序列通过重组法合成。目前已知许多通常不会改变分子活性的蛋白质和多肽中的氨基酸变换。最常发生的变换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，以及它们的反向变换。此外，根据本专利技术的多肽包括根据SEQ ID NO2的多肽，特别是那些具有FAD依赖的EN4P脱氢酶的活性的多肽，以及那些与SEQ ID NO2的多肽具有至少80％到85％，优选的至少86％到90％，更优选的至少91％到95％，特别优选的超过95％的同一性，并具有所提及的活性的多肽。为了高效的表达pdxR或编码FAD依赖的EN4P脱氢酶的DNA序列，可以使用多种启动子；例如，存在于pdxR基因上游的原始启动子，抗性基因例如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的启动子(lac)，苜蓿中华根瘤菌的核糖体小亚基的启动子(pS1)，trp启动子，tac启动子，trc启动子，和任何能在包括诸如大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌的细菌的微生物宿主体内具有功能的启动子。为了达到前述的目标，可以向编码序列中导入在宿主细胞中可操作的其他调控元件，例如Shine-Dalgamo(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主体内可操作的自然的和合成的序列)和转录终止子(反向重复结构包括任何在宿主细胞中可操作的自然的和合成的序列)，与上述启动子共同使用。可以使用各式各样的宿主/克隆载体组合来克隆该双链DNA。克隆载体通常是质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括编码黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的Ｄ－赤糖酸４－磷酸脱氢酶ＰｄｘＲ的核苷酸序列的分离的ＤＮＡ，所述核苷酸序列选自如下构成的组：（ａ）由ＳＥＱＩＤＮＯ：１或其互补链确定的ＤＮＡ序列；（ｂ）在标准条件下与（ａ）定义的Ｄ ＮＡ序列或其片段的互补ＤＮＡ序列杂交的，并编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的Ｄ－赤糖酸４－磷酸脱氢酶活性的多肽的ＤＮＡ序列；（ｃ）编码具有（ａ）或（ｂ）的ＤＮＡ序列编码的氨基酸序列的多肽的ＤＮＡ序列；（ｄ）与编码包含ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２的氨基酸序列的多肽的ＤＮＡ具有至少８０％的同一性，并编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的Ｄ－赤糖酸４－磷酸脱氢酶活性的多肽的ＤＮＡ序列；和（ｅ）编码包含与ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列具有至少８０％同一性的氨基酸 序列的多肽，并编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的Ｄ－赤糖酸４－磷酸脱氢酶活性的多肽的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：星野达雄，市川敬子，田副正明，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]