一种重组水蛭素编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组水蛭素编码基因与应用。该重组水蛭素编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列２自５′末端第７－４５９位所示。本发明专利技术还公开了一种重组表达载体，该重组表达载体含所述水蛭素编码基因。将该重组表达载体导入多形汉逊酵母中可获得的重组菌。该重组菌能高水平生产重组水蛭素；所生产的重组水蛭素具有高抗凝比活性。生产的重组水蛭素可制备血液或血浆的通用抗凝剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组水蛭素编码基因与应用。技术背景水蛭素是凝血酶的特异性直接抑制剂，水蛭素最初从欧洲医蛭唾液腺中提纯，现在用重组DNA技术可大量制备。水蛭素是由65个氨基酸残基组成的单链多肽，分 子量为7,000Da。对其抑制作用的机理已做了大量研究。水蛭素分子包括两个功能 区含3个二硫键结构的N端核心区域(1-52残基)和无规则的C端尾部(53-65残基)。 水蛭素与凝血酶以l : 1的方式形成一个非常紧密的非共价的可逆复合物，N端核心 区域结合于凝血酶的水解活性位点，而C端尾部则结合于凝血酶对纤维蛋白原的识 别位点。两个功能区以一种相互协调的方式与凝血酶结合。同时，水蛭素中的Pro46、 Lys47、 Pro48三肽结构，起着促进N端与活性位点结合等重要作用。水蛭素对凝血酶 具有高度亲和性抑制作用，它是迄今为止世界上最强的凝血酶特异抑制剂。多形汉逊酵母(学名尸ic力ia a/7^/sfs，曾用名jyay seyw2a / Wj^orp力3)是目前 国际上公认的一种理想的外源基因表达系统，适于大规模工业化生产外源蛋白。多 形汉逊酵母的技术优势和产业化应用价值可归纳为①多形汉逊酵母的外源基因整 合于细胞染色体中，重组菌株有丝分裂遗传稳定性高；②可利用甲醇氧化酶基因(M0X)和甲醛脱氢酶基因(FMD)等强启动子，高效地启动外源基因的表达；③具 有自主复制序列(HARS)，重组的频率高，重组质粒可以高拷贝整合到染色体上， 易获得高拷贝整合的转化子；④蛋白的表达通常在过氧化物酶体内进行，可使其免 受细胞内蛋白酶的降解，并降低了对细胞的毒害作用；⑤能利用廉价的化学合成培 养基进行细胞高密度发酵，不需要添加价格昂贵的天然组分，进一步降低了生产成 本并提高了外源基因的表达水平；⑥耐高温，最适生长温度为37-43°C，生长速率 快，大规模发酵的培养时间短；⑦发酵中以甘油或甲醇为唯一碳源和能源，能利用 甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，发酵染菌率低；⑧外源蛋白的表达 量和分泌效率比酿酒酵母高10倍左右，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规 模发酵生产目的蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组水蛭素编码基因与应用。本专利技术提供的一种重组水蛭素编码基因，其氨基酸序列是序列表中的序列2自5'末端第7-459位所示；其中，所述重组水蛭素编码基因采用多形汉逊酵母偏爱密码子。含有所述基因 的重组表达载体也属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体是如图1所示的pMPT-hirudin载体。 本专利技术的另一个目的是提供一种含有所述基因的重组菌。 将所述重组表达载体导入多形汉逊酵母中可获得含有所述基因的重组菌。 其中，所述重组多形汉逊酵母的出发菌株可为专利技术专利CN1651570A中所述的 多形汉逊酵母HU-II CCMCC NO. 1218。多形汉逊酵母HU-II CCMCC NO. 1218中乳清 酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)的第31位核苷酸残基后插入"GAACT" 5个碱基， 从而产生移码突变，移码突变导致第10位后的253个密码子全部被置换并且突变 产生了共15个终止密码子，这表明URA3的结构基因已不可能再表达。GAAGT五个 碱基同时产生回复突变的概率极小，实验也证明多形汉逊酵母HU-II CCMCCNO. 1218 的回复突变率为零；这种"0"回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。 所述重组菌是多形汉逊酵母(学名尸icAz'a朋^/s&，曾用名ife/^e/wh pW，oip力3)205-17，所述205-17已于2008年3月28日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保 藏号为CGMCC No. 2424。本专利技术所述的基因、所述的重组表达载体或所述重组多形汉逊酵母菌在生产水 蛭素中的应用。本专利技术的重组多形汉逊酵母菌中重组水蛭素基因高拷贝整合，实时荧光定量 PCR检测外源基因整合拷贝数高达198个，外源基因整合拷贝数为198个的重组多 形汉逊酵母命名为多形汉逊酵母205-17 CGMCC No. 2424。本专利技术的重组多形汉逊酵母菌生产水蛭素的实验结果表明，每升发酵上清液中 重组水蛭素的含量达到2. 0克左右；经过阳离子交换层析和反相层析纯化，纯度95% 的重组水蛭素达到1. 0克左右/升发酵上清液，生色底物法检测该纯度重组水蛭素 的比活性达到19000ATU/mg。实验证明本专利技术的重组水蛭素能够抑制凝血酶的活性，可用于制备血液和血浆 的抗凝剂。 附图说明图l为pMPT-hirudin载体的构建示意图具体实施方式实施例1、重组水蛭素基因的获得水蛭素是由65个氨基酸组成的活性多肽，将氨基酸解译为相应的密码子时， 尽量使氨基酸的密码子的频数分布与多形汉逊酵母偏爱密码子频数分布一致，为了 便于克隆和表达，N端前面加了必须的碱基顺序，包括限制性内切酶识别位点 I和^a历^I及酿酒酵母a信号肽序列，并反复搜寻调整使基因中不存在7个碱基 以上的发卡结构序列；不存在启动子序列和核糖体结合位点如转录起始序列TATA 和翻译位点GGAGG;不出现下列终止子序列如ATTATTTTAT、 TTTTTATA (富含 AT)…TTT、 TAG (富含T) TA (T) GT等；只存在最高1处为7个碱基正向重复序 列；并且基因转录后的RNA序列二级结构自由能降低至-135.90 kcal/mo。最终确 定由474个碱基组成的整个序列，如序列表中序列2所示。利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列。其中，序列2的自 5'末端第7-459位序列编码酿酒酵母a信号肽和水蛭素的融合蛋白；序列2的自 5'末端第262-459位为水蛭素基因的编码序列，编码序列表中序列1的蛋白。^MI和fe/^I酶切合成的DNA序列，电泳回收酶切后的片段，-2(TC保存备用。实施例2、构建生产重组水蛭素的重组多形汉逊酵母a) 载体pMPT-02的构建以多形汉逊酵母CGMCC 2. 2497基因组DNA为模板，克隆1. 5kb的甲醇氧化酶 基因(MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、l.Okb的自主复制 序列HARS;并从YIp5 (GenBank Acession No. L09157)质粒中克隆出1. lkb的酿 酒酵母脲嘧啶基因ScURA3;将上述4部分连接后，插入pBluescripII质粒的多克 隆位点，构建成穿梭载体pMPT-02。b) 载体pMPT-hirudin的构建用fcoT I和^3/^1酶切载体pMPT-02，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的 大片段，T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的合成的DNA序列连接，得到载体 pMPT-hirudin,见图1。c) 重组菌的获得用5"sc/酶切载体pMPT-hirudin,使载体线性化。线性化的载体通过电转化法(天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，1.5kV， 50uF， 200 Q， 3-5mSec) 转化多形汉逊酵母(泡/^e"〃h/ oA/z orp力3) CGMCCNO. 1218。在含有13. 4g/1000ml YNB (酵母氮源基础培养基)，20g/1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组水蛭素基因，所述基因的核苷酸序列是序列表中序列２自５′末端第７－４５９位所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪和睦，王昌华，王玉香，杨珺，
申请(专利权)人：汪和睦，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]