一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用，其目的是提供一种遗传较稳定的重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与其在生产外源蛋白中的应用。本发明专利技术所提供的重组多形汉逊酵母菌，是乳清酸苷－５－磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。其构建方法包括以下步骤：１）构建乳清酸苷－５－磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；２）将步骤１）中的重组载体导入野生型多形汉逊酵母菌中，筛选得到乳清酸苷－５－磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。本发明专利技术的重组多形汉逊酵母菌将在外源蛋白的生产中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用，特别是涉及一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与其在生产外源蛋白中的应用。
技术介绍
酵母菌作为单细胞真核生物，既具有原核生物生长快，遗传操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控和翻译后修饰机制，因此是生产真核生物活性蛋白理想的表达系统。在过去20多年的时间里，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为第一个真核基因表达系统得到了广泛的应用。但这一表达系统在应用过程中也存在诸多不足之处，如外源基因表达水平不高、表达蛋白的分泌水平低及多肽链糖基化过度、菌株不稳定等。而其他的酵母菌株，尤其是甲醇营养型酵母在外源基因的表达上则显示出更大的优势重组菌株遗传稳定性高，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10-100倍，且没有过度糖基化的现象，因此适于大规模发酵生产目的蛋白。其中的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)除具有上述优点外，还具有其特有的优势(1)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子高效地启动外源基因的表达；(2)非同源重组的频率高，因而重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子；(3)表达的外源蛋白通常贮存在过氧化物酶体内，可使其免受胞内蛋白酶的降解，并且降低了对细胞的毒害作用；(4)能用廉价的培养基进行高密度发酵，进一步提高外源基因的表达水平；(5)耐高温，最适生长温度为37℃-43℃，生长速率快，大规模发酵的培养时间短、污染率低。因此，多形汉逊酵母是目前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一，适于大规模工业化生产外源蛋白。有效的酵母表达系统包括两个主要元件启动外源基因高效表达的载体系统和具有特定筛选标记的宿主细胞。在多形汉逊酵母表达系统中，主要利用的是带有营养缺陷筛选标记(leu、ura、trp或ade)的宿主细胞。由于多形汉逊酵母同源重组的频率较低，只有当两侧的同源序列大于1kb时才可能利用类似于酿酒酵母的基因阻断法获得基因阻断突变株，因此目前使用的营养缺陷型菌株多是通过化学诱变得到的，它们突出的缺点是遗传稳定性较低，难于获得理想的转化子，而且可能存在多重突变效应，使细胞的生理生化特性与野生型细胞存在明显差异，为大规模工业生产带来不便。因此通过现代生物学技术构建遗传稳定的、只有特定基因功能被阻断的基因表达宿主菌是多形汉逊酵母表达系统更好地应用于工业生产亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种遗传较稳定的重组多形汉逊酵母菌。本专利技术所提供的重组多形汉逊酵母菌，是乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3被阻断的多形汉逊酵母菌。所述重组多形汉逊酵母菌的代表是多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，已于2004年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1218。其菌落呈凸起状、乳白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈椭圆形，该菌株的最适生长温度为37℃，pH为5.5。本专利技术的第二个目的是提供一种构建上述重组多形汉逊酵母菌的方法。本专利技术所提供的构建上述重组多形汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤1)构建乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；2)将步骤1)中的重组载体导入野生型多形汉逊酵母菌中，筛选得到乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被阻断的多形汉逊酵母菌。其中，所述筛选标记基因可为G418抗性基因、新霉素抗性基因或铜离子抗性基因。所述G418抗性基因可为KanMX。所述KanMX可来源于pFA6a-KanMX。用于构建所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被筛选标记基因灭活的重组载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒载体、丝状噬菌体载体或酵母菌穿梭载体，优选为pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等，尤其优选为pUC18或pUC19。所述野生型多形汉逊酵母菌优选为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621。所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体可为pHURK。所述重组多形汉逊酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11CGMCC No.1218。本专利技术的重组多形汉逊酵母菌可用于生产外源蛋白，在实际应用中，可将目的基因导入多形汉逊酵母表达载体，得到重组表达载体，将含有目的基因的重组表达载体转化多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，利用营养缺陷互补筛选获得重组菌，对重组菌进行诱导培养，得到外源蛋白。所述外源蛋白为淀粉酶或植酸酶。本专利技术利用小片段同源序列介导的同源整合及多形汉逊酵母细胞内高频率非同源重组的发生构建了乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被阻断的重组多形汉逊酵母菌。本专利技术通过基因工程手段，构建了遗传稳定、尿嘧啶营养缺陷型的重组多形汉逊酵母菌(尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌)，特别是多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，该菌株比目前国内外所用的营养缺陷型宿主菌遗传稳定性高，回复突变率低，便于进行遗传转化和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株的培养和外源蛋白的高效表达，具有较高的工业应用价值。附图说明图1为重组质粒p18HURA的构建示意2为尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌的构建示意3为质粒pMOX-Amy的物理图谱图4为质粒pMOXα-Amy的物理图谱图5为质粒pMOXα-appA的物理图谱具体实施方式下述实施例中所有涉及含量的百分数均为质量百分数。下述实施例中所用限制性内切酶均购自TaKaRa公司。实施例1、多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218的构建及其生物量和生物活性的检测一、构建含有多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA如图1所示，重组质粒p18HURA的构建过程如下1、多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的获得根据已报道的多形汉逊酵母菌的HURA3的核苷酸序列设计的引物序列如下引物15′-CCAGGATCCTCAACATTTCCCTGAATAAT-3′(序列表中的序列1)(划线部分碱基为BamHI识别位点)引物25′-CGAGAATTCTCACTAGTATTCCCGCGACT-3′(序列表中的序列2)(划线部分碱基为EcoRI识别位点)以多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621(ATCC34438)的总DNA为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应扩增HURA3，PCR反应体系为模板DNA 0.6μg，引物1 0.5μmol/L，引物2 0.5μmol/L，dNTP 200μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，pfu DNA聚合酶(Promega公司)1单位，用去离子水补至50μL，混匀后加入20μl石蜡油；用国产PCR仪TC-9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组多形汉逊酵母菌，是乳清酸苷－５－磷酸脱羧酶基因被阻断的多形汉逊酵母菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何秀萍，张博润，汪和睦，
申请(专利权)人：汪和睦，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]