本发明专利技术涉及一种产生抗肿瘤活性物质的极地海洋放线菌ＡＦＮ１００７的鉴定和发酵，及其发酵液的抗肿瘤活性研究，属于微生物药物领域。菌株ＡＦＮ１００７经传统分类及其１６Ｓ ｒＤＮＡ基因分析，鉴定为链霉菌属的一个新种。该菌株应用培养基（黄豆粉１％，可溶性淀粉１％，ＫＮＯ↓［３］ ０．１％，ＭｇＳＯ↓［４］ ０．０５％，ＦｅＳＯ↓［４］ ０．００１％，ＮａＣｌ ０．０５％，天然海水，ｐＨ ７．２～７．４）进行发酵，通过ＭＴＴ法，发现其发酵液对４种肿瘤细胞ＫＢ、ＢＧＣ ８０３、Ｈｅｐ Ｇ２和Ｈｅｌａ具有较强的抗肿瘤作用，有望从中发现新结构的抗肿瘤化合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产生抗肿瘤活性物质的极地海洋放线菌AFN1007的鉴定、发酵及其发酵 液的抗肿瘤活性，属于微生物药物领域。
技术介绍
1929年，英国的Fleming发现微生物产生青霉素以来，已经证明微生物(包括细菌、放线菌、真菌等)是生物活性物质的丰富源泉。微生物能够产生抗菌、抗肿瘤、抗病毒和抗心血管疾病的生物活性物质。据统计，人们己经从微生物中发现了 8000多种具有抗菌和抗肿瘤活性的天然产物。然而，从陆生微生物中新发现的生物活性物质的种类正在减少，并且大部分是已知的化合物。另一方面，越来越多的传染性病菌对传统抗生素逐渐产生了抗药性，威胁人类健康的三大疾病之一的癌症也难以找到有效的治疗药物，从而迫使生物学家寻找新的天然生物活性物质来解决目前面临的问题。海洋微生物将成为下个世纪开发新型药物的重要资源，同时极地也就成为最有希望为人类提供产生具有生物活性的新化合物的微生物资源宝库。极地具有独特的地理及气候特征，除短暂的夏季部分地区有冰雪融化外，其余均被常年的冰雪所覆盖。变化极大的光照辐射、季节性的光照时间、极低的温度造就了极地微生物特殊的生物学特征。自1908年Ekelof首次报导在南极分离出微生物后，各国的微生物学家相继在极地进行了大量的研究工作，证明了极地微生物在基础研究和开发应用方面具有广阔的前景。因此，极区也被认为是个潜在、重要的微生物资源库，也可能是产生新型生物活性物质和先导化合物(如酶、抗生素、多糖及脂类等)菌株的潜在种源地。本实验室从极地海洋沉积物样品中分离到一株具有抗肿瘤活性的放线菌AFN1007。通过传统分类和16S rDNA基因分析，将其鉴定为链霉菌属的一个新种；其发酵液具有较高的抗肿瘤活性，有望从中获得新结构的抗肿瘤活性物质。
技术实现思路
本专利技术的目的是鉴定极地海洋放线菌AFN1007，研究其发酵液的抗肿瘤活性。 本专利技术涉及极地海洋放线菌的鉴定，即经过传统分类和16S rDNA基因分析，将其鉴定为链霉菌属的一个新种。菌株AFN1007应用培养基(黄豆粉1%，可溶性淀粉1%， KN03 0.1%， MgS04 0.05%， FeS04 0.001%， NaC10.05%，天然海水，pH 7.2-7.4)进行发酵，通过MTT法，发现其发酵液对4种肿瘤细胞KB (口腔上皮癌细胞)、BGC 803 (胃癌细胞)、Hep G2 (肝癌细胞)和Hela (宫颈癌细胞)具有很强的抗肿瘤作用。附图说明图1是以16S rDNA为基础构建的N-J进化树 图2是放线菌AFN1007的发酵时效曲线具体实施方式实施例11、 采用插片法在高氏合成一号培养基上培养AFN1007，在Olympus BH-2光学显微镜下 观察菌丝体，其孢子链呈现规则的螺旋型，属于链霉菌属。2、 依照国际链霉菌计划(ISP)及Waksman所推荐的培养基配方对海洋菌株AFN1007 进行培养，并观察培养特征和生理生化特性。菌株AFN1007在8种培养基上均生长良好，基内菌丝多数为白色或黄色，气生菌丝均为 白色，孢子丝多数为白色，分泌红色、灰绿色两种可溶性色素(表l)。表1.极地放线菌AFN1007的培养特征<table>table see original document page 4</column></row><table>放线菌AFN1007在含NaC15^。-80^范围的培养基上可以生长。可以利用葡萄糖、蔗糖、 乳糖、木糖、棉籽糖、甘露醇、肌醇七种碳源。产酶活性中除淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢 酶和牛奶凝固活性为阳性，其它都为阴性；结果见表2。表2.极地海洋放线菌afn1007的生理生化特征<table>table see original document page 5</column></row><table>注耐盐性实验中，"+ "表示生长趋势，"一"表示不生长；产酶活性实验，"+ "表示产生该酶， "一"表示不产生该酶；糖利用实验中，"+ "利用该种碳源，"一"不用该种碳源。 3、 采用Lechevalier全细胞壁制备方法及王平快速薄层分析法对全细胞壁氨基酸和糖组 份进行分析。结果发现，菌株AFN1007细胞壁中只含L,L-二氨基庚二酸(L,L-DAP);无特 征性糖，属于细胞壁I型，糖型C，与链霉菌的细胞壁特征相同。 4、 采用酚氯仿抽提法，提取菌株总DNA。应用16SrDNA引物正向引物P1 (5'- CGGAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3')和反向引物P2 (5' - AAA GGA GGT GAT CCA GCC GCA-3')进行PCR扩增。25ix LPCR反应体系:去离子水12.2uL， 10xPCR buffer 2.5pL， MgCl2 2.0 mM， dNTP 0.4mM， PI 0.6pM， P2 0.6pM， Taq酶1.5U，总DNA LOp g。扩增程 序为94。C预变性5min;然后94'C变性45s， 55。C复性45s， 72'C延伸2min进行30个循环; 最后于72'C延伸10min。PCR产物直接送上海生工生物技术公司测序。测得菌株AFN1007的16SrDNA基因核苷 酸序列全长1500bp,将该序列输入GenBank数据库，进行同源性搜索，获取16SrDNA基因 序列相似度高的菌种(表3)。该菌与链霉菌属的NBRC 12748T和NBRC 128377同源性分别为98.02%和98.01%，与美国加州大学发现的属于链霉菌科但还未确定属的CNQ857、 CNQ530、 CNQ687、 CNQ719和CNQ698五株海洋放线菌的同源性都小于98% 。采用Clustsl X进行多序列匹配比对,通过Mega 3.1软件，采用Neighbor-Joining构建系统进化树(见图1 )。 从图1可以看出，菌株AFN1007与链霉菌科中的菌株相比，菌株AFN1007与这7株菌聚为 簇，该菌不与这7株菌中的任何一个单独相聚，形成了一个独立的亚分枝，提示该菌株是 一个新种。表3极地海洋放线菌AFN1007与相关菌株的相似度Strain NameSourceAccession Numb6「SimilarityS.cacaoi subsp. cacaoiNBRC 12748AB18411598.02%S. cacaoi subsp. cacaoiNBRC 12837AB18418398.01%Streptomycetaceae bacteriumCNQ857AY46454597.99%Streptomycetaceae bacteriumCNQ530AY46454197.63%S. 3lbus subsp. 3lbusDSM 40313AJ62160297.48%S. almquistiiNBRC 13015AB18425897.48%S. V3rsoviensisNBRC 13093AB18430697.48%Streptomycetaceae bacteriumCNQ687AY46454297.31%S. 6rump6nsDSM 40941AJ621603本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离自极地海洋沉积物的放线菌ＡＦＮ１００７的鉴定、发酵及其发酵液的抗肿瘤活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：奚涛，那广水，张婷，沈晶，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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