用滚环扩增法扩增多核苷酸制造技术

利用滚环扩增来扩增和检测靶核酸分子，其通过在靶核酸分子上连接第一和／或第二接头核酸分子或第二接头核酸分子，然后环化靶核酸分子，再扩增该环化的核酸分子以产生重复的核酸序列。可利用此方法扩增核酸，特别是ＲＮＡ，以进行检测和克隆。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉参考相关申请本申请要求专利技术人Youxiang Wang和Yaping Zong于2003年9月26日提交的标题为“滚环扩增法扩增多核苷酸序列”的美国专利申请No.60/506,218的优先权。专利
本专利技术属于用滚环扩增法(RCA)扩增核酸的领域。
技术介绍
在鉴定基因中，获得全长cDNA是关键但常常是困难的任务。构建cDNA文库的传统方法通常只能产生部分cDNA片断。cDNA末端的快速扩增(RACE)是为恢复全长编码序列而开发的一项技术，然而，RACE技术仍然复杂且效率不佳。我们的专利技术采用RT-RCA技术，其为制备全长cDNA提供了大为改进和简化的方法。 RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)是用于检测和定量mRNA的高灵敏技术。该技术由两部分组成通过逆转录(RT)从RNA合成cDNA，和通过聚合酶链式反应(PCR)扩增特异性cDNA。我们的专利技术采用RT-PCR技术，其提供了用滚环扩增法使扩增和检测mRNA大为改进且更简单的方法。 已建立的核酸扩增方法包括以温度循环为基础的方法例如PCR、LCR和SPA，及采用等温扩增的方法例如NASBA、RCA、TMA、Qβ复制酶和SDA。最近，已开发了各种利用RCA的检测和扩增方法，参见例如美国专利No.5,871，921、5,648,245、5,866,377、5,854,033、6,287,824、6,323，009。 专利技术概述 本专利技术提供了利用滚环扩增检测和克隆核酸分子的方法。本专利技术提供了利用滚环扩增从复合混合物中扩增、检测和克隆靶核酸分子的方法。本专利技术的许多优点可见于各种实施方案中。 在一个实施方案中，本专利技术提供了用于环化整个靶核酸分子以进行扩增的方法。此方法能克隆大多数靶核酸的全长序列，如果需要的话，也能扩增和克隆整个基因组。 在另一个实施方案中，本专利技术提供利用滚环扩增来扩增和检测靶核酸分子所需区域的方法。 在另一个实施方案中，本专利技术提供利用发夹环以产生用于滚环扩增和检测的环形多核苷酸的方法，而不是使用锁式探针(padlock probe)或附加模板以连接形成环形核酸分子的方法。 在另一个实施方案中，本专利技术提供通过采用自身引发(self-priming)接着通过连接而闭合环来环化核酸分子的方法。 在另一个实施方案中，本专利技术提供的检测方法，利用靶序列本身产生游离3’端而引起环化核酸分子的滚环扩增，其中环化的核酸分子可包含用于基因特异性检测和扩增的全长基因序列，其中不需要加入引物。这使得检测扩增不需要连接，几乎不需要或不需要外部提供的引物，从而简化了整个反应。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了基于靶核酸分子与所供给寡核苷酸或片段之间的相互作用，从所供给的片段或寡核苷酸而不是靶序列产生用于环化核酸分子滚环扩增的游离3’端的方法。 在另一个实施方案中，本专利技术提供多个方法来检测和扩增靶多核苷酸序列，其包包括用环化寡核苷酸分子进行突变检测。一方面，不必先经PCR扩增而环化靶核酸分子。靶核酸分子的环化可包括该靶核酸、其互补物的环化或二者均被环化。如果需要或者希望，可产生或提供游离的3’端。然后用滚环扩增法扩增该环化的核酸分子。 本专利技术的多个实施方案采用不同的方法来环化靶核酸分子(或其互补物)。通常靶核酸分子的环化可采用许多不同的方法，例如用酶(如T4DNA连接酶)或化学方法连接、光化学反应、用酶(如Cre-重组酶)进行位点特异性或同源性重组、以及各种形式的聚合酶延伸法。环化，例如采用酶(如Cre-重组酶)进行重组，可能需要将特异性序列结合到靶核酸分子(或其互补物)的一端或两端。此外，本专利技术的环化方法可能需要或可能不需要将特异性序列加到复合混合物中的靶核酸分子(或其互补物)的一端或两端。被加到靶核酸分子两端的特异性序列分别称为第一接头核酸分子和第二接头核酸分子。在一个实施方案中，将第一接头核酸分子连接于靶核酸分子。该第一接头核酸含有能使其与靶核酸分子连接的序列或部分。该第一接头核酸分子可可选择地包含可用于后面环化、克隆、检测、扩增或产生RNA的其它确定的序列。不限于上述概念，这种确定的序列包含有限制性内切核酸酶位点、Cre-lox交叉重叠位点、RNA聚合酶启动子位点、聚合酶终止位点、发夹环结构等。例如，该第一接头可含有限制性内切酶位点，借此可在靶核酸的一端或两端产生粘性末端。如果这两个粘性末端是互补的，或通过所提供的发夹环引物的两个粘性末端相连接，所得到的靶核酸可以被环化。 在另一个实施方案中，通过与靶核酸分子杂交或与靶核酸分子连接可以将第一接头核酸分子添加到靶核酸分子。在利用杂交的实施方案中，第一接头核酸分子在其3’端有一用于杂交的互补区。例如，该互补区可以是能与mRNA的聚A尾杂交的聚T序列。如果靶核酸的序列是已知的话，则另一个实施例是确定的序列。如果靶核酸的序列是未知的，那么该互补区可以是能随机杂交的随机短序列，例如六聚、七聚、八聚、九聚、十聚、十一聚或十二聚序列。在某些实施方案中，如果靶核酸是RNA，则可在与靶核酸分子杂交后通过加入聚合酶(如逆转录酶)来延伸该第一接头核酸，该第一接头核酸可含有靶的环化所需的发夹结构。在另一个实施方案中，一旦聚合酶抵达模板链的末端，即可将特定的核苷酸加到新生链的末端。例如，MMLV逆转录酶可将胞嘧啶核苷酸加到新生链的末端。可直接使用这种突出端，或将其用于延伸，例如将寡聚核苷酸转换而环化靶核酸以确保扩增全长靶核酸。例如，可将发夹环寡(核苷酸)转换引物直接连接于所加的胞嘧啶核苷酸，或作为模板进一步延伸所加的胞嘧啶核苷酸，然后与发夹环寡转换引物相连。在其它实施方案中，末端转移酶被用于产生这种突出端。在其它实施方案中，第一接头核酸分子可包含接头池，在其3’端具有随机序列，在其5’端具有可选择的预选任意序列，包括确定的结构序列。可以将这种第一接头核酸分子与单链或双链靶核酸分子一起使用。对于单链靶核酸分子，该第一接头核酸分子可具有发夹结构，可接连于两端，然后延伸并连接以进行环化。对于双链靶核酸分子，由于该双链靶核酸分子两端在“呼吸”时或通过双链的变性的随机解链，随机序列在双链靶核酸分子的两端发生杂交。该第一接头核酸分子作为模板，来延伸双链靶核酸分子的两端，以产生用于环化的突出端。此外，该第一接头核酸分子可具有发夹结构，可在环化延伸之前或之后或不延伸时，连接于双链靶核酸分子的两端。因此，这种接头核酸分子可用于环化未知或已知序列的整个靶核酸分子。 在某些实施方案中，在靶核酸(或其互补链)环化前或作为其环化的一部分，将第二接头核酸分子连接到靶核酸或靶核酸的互补链上。该第二接头核酸分子含有能使其连接到靶核酸分子上的序列或部分。该第二接头核酸可选择地还含有与第一核酸分子互补的区域，从而能通过重组如通过Cre-LoxP系统而环化。例如，利用含LoxP序列的polyT作为RT引物和含LoxP序列作为寡聚转换引物，将LoxP序列加到靶mRNA的两端。使用Cre-重组酶可以环化所得的两端含LoxP序列的RNA-DNA双链体。可用RNA酶H使RNA产生缺口从而作为进行滚环扩增的引物。在其它实施方案中，第二接头核酸分子可包含具有粘性末端的发夹结构，并可与靶核酸的粘性末端连接以形成环形结构。在另一个实施方案中，第二接头核酸分子可含有能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增和检测靶核酸分子的方法，该方法包括：　ａ）在靶核酸分子上连接第一接头核酸分子或第二接头核酸分子或第一接头和第二接头核酸分子的组合；　ｂ）环化靶核酸分子；　ｃ）扩增该环化的核酸分子产生重复的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：王友祥，宗亚平，
申请(专利权)人：首科安普有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]