一种大批量快速制备ＰＣＲ模板的方法技术

一种大批量快速制备ＰＣＲ模板的方法，属植物分子检测技术领域，具体涉及植物组织在裂解液中加热裂解和裂解液中和。本发明专利技术的技术方案是：将微量植物叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解，然后中和，反应混合液可直接作为ＰＣＲ反应的模板，在添加适量聚合酶稳定剂的情况下，ＰＣＲ反应稳定，重复性强。该方法特别适宜大批量ＰＣＲ反应模板的快速制备，可以大幅度提高分子检测和遗传分析的效率，极显著地降低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种大批量快速制备PCR模板的方法
本专利技术涉及一种PCR模板的制备方法，尤其是一种大批量快速制备PCR模 板的方法和试剂配方。植物组织通过裂解液裂解和中和液中和后，直接作为PCR反应模板进 行PCR扩增分析，为大批量进行植物基因组遗传分析提供模板。
技术介绍
随着分子生物学的迅速发展，生物技术的研究领域逐渐拓展到生物科学的 各个方面，核酸水平的研究是分子生物学研究的重要内容，PCR (polymerase chain reaction) 技术作为研究核酸的主要工具，在分子生物学领域扮演着越来越重要的角色。应用PCR技术 研究核酸的前提是制备PCR反应的模板，也就是将生物组织内的遗传物质如DNA释放出来， 供PCR分析之用。目前较常规提取植物基因组DNA的方法主要有CTAB (王丽，乔爱民，孙一铭，等.菜心基 因组DNA提取及RAPD反应体系的优化.西南师范大学学报，2006,31(2) :124-128)和 SDS(聂珍素，赖钟雄，潘东明，等.橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化.亚热带农 业研究，2005， 1(2):6-8)法，这两种方法各有优缺点，但是都需要对植物组织进行低温研磨、 高温裂解、残渣分离、去除蛋白、RNA、盐类等杂质、沉淀DNA并离心分离等步骤，程序复杂、 操作繁琐、时间长、成本高、所需较多的植物材料，而且提取过稃中要用酚、氯仿等对人体 有害的有机试剂。另外，需要的药品很多，尤其是需要提取大批量材料的DNA样品时，山于 研磨和提取DNA过程中许多器皿不得不重复使用，往往对于污染高度敏感的PCR反应会产生 严重影响。本专利技术根据碱裂解原理， 研制不改变PCR反应缓冲液成分的裂解液配方，提出增加酶稳定剂以降低杂质干扰的理念， 最终专利技术了 一种免除DNA抽提制备PCR反应模板的新方法，和已有DNA制备方法相比，该方 法具有简便、快速和高效的突出优点。以有代表性的单子叶和双子叶植物的叶片为供试材料， 经过对不同种类的植物组织、多种引物的PCR反应的反复验证，证实了这种方法的可行性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高通量制备PCR模板的方法，简便快速地制备 大批量适于PCR检测的模板。该方法只需要微量的植物材料，且不需要抽提植物DNA，能应 用于大批量活体植物组织的快速分子检测，为植物大批量活体分子检测提供了一种新的方法。本专利技术是一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于通过以下歩骤实现1) 量取等体积的Solution A和Solution B，添加灭菌双蒸水并充分混匀后得裂解液， 备用；所述的Solution A为1 mol/L KOH的水溶液；Solution B为20% Tween-20的水溶液； 所述灭菌双蒸水的添加量为Solution A使用量的8倍；2) 取50 uL裂解液于离心管中，然后置测试材料于离心管的裂解液中，短暂离心后， 在PCR仪上93 98。C保持10 15min;所述测试材料为供试作物的叶片，其使用量以能够完 全浸入离心管的裂解液中为宜；3) 取出离心管并迅速放冰上；向离心管中加入50 uL的Solution C，混匀，即可直 接用作PCR反应模板；所述Solution C为TE缓冲液，TE缓冲液成分0. 1 M Tris-HC1和2 mM EDTA的水溶液。4) 模板的PCR检测，在PCR反应体系配制的过程中，先添加Solution D 2. 5 uL / 每管；然后进行PCR反应和电泳成像；所述PCR反应和电泳成像为常规技术；Solution D 为WBSA水溶液。本专利技术的一种大批量快速制备PCR模板的方法，完全区别于传统的CTAB法和SDS法，可 直接跳过抽提基因组DNA这种繁琐的步骤，通过KOH碱裂解析出的微量基因组DNA为模板进 行PCR分析，且没有引进新的可能影响PCR反应的离子，是一重大的进歩。特别适用于受试 材料量极少或活体的大批量快速检测，更能充分显示其优点。该方法经过对不同种类的作物 组织、多对引物的PCR反应的反复验证，证明是一种具有广泛应用价值的PCR检测模板的制 备方法。Solution A主要是为了溶解细胞，释放基因组DNA;Solution B是一种非离子型去污剂，在乳化蛋白时不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白 质之间原有的相互作用的破坏；Solution C是进行中和Solution A溶液的缓冲液；Solution D在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，降低杂质干扰，从而提高PCR 的扩增效率。本专利技术具有的特点为利用一种新鲜配制的对PCR反应影响很小的碱混合液，在加热条 件下对作物组织进行消化裂解，释放出基因组DNA，然后中和。中和反应液可直接作为PCR 反应模板进行PCR扩增分析。这种方法在单子叶和双子叶作物中经过验证，具有广泛的适用 性。该方法具有简单、快速、成本低等特点。该方法对于大批量PCR分析具有特殊的意义。本专利技术具有的优点为1) 快速高效，特别适用于大批量PCR检测分析样品从植物组织到PCR反应的模板，耗 时不足半小时，并且随样品数的增加，制备单个样品的时间就越短。裂解液可直接作为PCR 反应模板使用，不用沉淀分离DNA，进一步提高了效率。2) 取样量少 一次取样量在毫克(mg)级水平，但可供近百次的PCR分析。对受试材料 几乎没有伤害，不会对其生长造成影响，完全可以满足受试材料活体分析的需要。3) 通用性强本专利技术方法可应用于多种作物组织制备PCR反应的模板，无论单子叶还是 双子叶植物，方法具有通用性。4) 操作简便易行不需要昂贵的仪器，特别是不用高速离心设备，样品制备简单，不需 要复杂DNA抽提和预扩增；操作过程简便易行，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验操作 歩骤。5)稳定性强该方法对于多种作物和多次重复试验，结果重复性好，显示该方法具有很 强的稳定性。 附图说明图1为玉米IVR内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M: DNA标准分子量 (TIANGEN BIOTECH);1，2，3，4,5,6:玉米郑单958叶片裂解液；7:阴性对照(以水替代裂解液)；8:阳性对照(郑单958DNA); 9:提取空白对照；10:试剂空白对照。图2为水稻SPS内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M: DNA标准分子量 (TIANGEN BIOTECH); 1,2，3，4，5，6:水稻籼优63叶片裂解液；7:阴性对照(以水替代裂 解液)；8:阳性对照(籼优63DNA); 9:提取空白对照；10:试剂空白对照。图3为甘蔗5SrDNA-ITS内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M: DNA标准分子 量(TIANGEN BIOTECH); 1,2，3,4,5，6:甘蔗福农95-1702叶片裂解液；7:阴性对照(以水 替代裂解液)；8:阳性对照(福农95-1702 DNA);9:提取空白对照；10:试剂空白对照。 图4为大豆lectin内源基因PCR反应产物电泳分析图；图中M: DNA标准分子量 (TIANGEN BIOTECH); 1,2,3,4,5,6:大豆叶片裂解液；7:阴性对照(以水替代裂解液)；8:阳性对照(鲁豆4号DNA) ; 9:提取空白对照；10:试剂空白对照。图5为棉花18本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大批量快速制备ＰＣＲ模板的方法，其特征在于通过以下步骤实现：（１）量取等体积的ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ和ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ，添加灭菌双蒸水并充分混匀后得裂解液，备用；所述的ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ为１ｍｏｌ／ＬＫＯＨ的水溶液；ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ为２０％Ｔｗｅｅｎ－２０的水溶液；所述灭菌双蒸水的添加量为ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ使用量的８倍；（２）取５０ｕＬ裂解液于离心管中，然后置测试材料于离心管的裂解液中，短暂离心后，在ＰＣＲ仪上９３～９８℃保持１０～１５ｍｉｎ；（３）取出离心管并迅速放冰上；向离心管中加入５０ｕＬ的ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ，混匀，即可直接用作ＰＣＲ反应模板；所述ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ为ＴＥ缓冲液，组成成分为０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ和２ｍＭＥＤＴＡ的水溶液；（４）模板的ＰＣＲ检测，在ＰＣＲ反应体系配制的过程中，先添加ＳｏｌｕｔｉｏｎＤ２．５ｕＬ／每管；然后进行ＰＣＲ反应和电泳成像；所述ＳｏｌｕｔｉｏｎＤ为１％ＢＳＡ水溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平华，王恒波，陈由强，陈如凯，许莉萍，郭晋隆，徐景升，蔡澜峰，潘永保，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]