一种单链TCR‑T载体及单链TCR‑T细胞生产工艺，该方案包括完整的HPV特异性TCR选取、TCR‑T载体构建、TCR‑T细胞工程以及人工改造TCR‑T细胞的活性检测。本发明专利技术采用了可识别主要组织相容性复合体(MHC)为HLA‑A2呈递HPV‑16 E6多肽的TCR序列，并将该序列转化为功能性的单链构象，在载体构建方面提出了全新的TCRα链和β链的稳定组装方式，在TCR‑T细胞工程方面使用稳定TCR‑T逆转录病毒生产细胞系。由该系列技术生产的HPVTCR‑T细胞能够被呈递HPV病毒多肽的受体细胞有效激活，将能够用于HPV引发的头颈癌、宫颈癌等疾病的治疗。
A production of single stranded TCR and single strand TCR T vector T cell technology
【技术实现步骤摘要】
一种单链TCR-T载体及单链TCR-T细胞生产工艺
本专利技术属于生物
，具体涉及TCR-T类免疫治疗技术及应用领域。
技术介绍
TCR-T技术是通过人工改造自体T细胞使其表达肿瘤抗原特异性TCR的细胞治疗技术。TCR-T细胞治疗包括肿瘤特异性TCR的选取、TCR表达载体的构建、TCR-T改造后细胞回输、免疫进程监测等关键技术和治疗手段。与同类型的CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)细胞治疗技术相比，TCR-T具有更广泛抗原选择空间，因此不仅能扩充其适用肿瘤范围，还有望减少脱靶效应[1]。然而，尽管TCR-T在临床前测试和小范围病人治疗中取得了一定成功[2,3]，TCR-T的临床试验数据仍然匮乏。同时，由于TCR-T的研发仍在初级阶段，临床治疗品质的TCR-T的载体构建和细胞生产策略还有待改进，更重要的是，TCR-T的有效患者人群以及新型构造的TCR-T的临床治疗效果仍有待证实。HPV病毒是一种人群感染率十分普遍的DNA病毒。HPV感染会造成粘膜上皮细胞增生，而高危型HPV感染会引发头颈癌、宫颈癌等病变。有报告指出，15-25％的头颈癌和几乎所有的宫颈癌都由HPV感染引起[4]。目前这类癌症的治疗方案较为单一，主要治疗手段包括放疗和顺柏类化疗药物。由于缺乏特征性突变，并没有针对HPV癌症的靶向药物。因此，研发HPV引起的头颈癌、宫颈癌的新型治疗方案有非常重要的临床意义。由于这类肿瘤有明确的HPV抗原表达谱，针对HPV抗原的主要TCR序列在过往的研究中已被阐明[5]，同时HPV抗原并无在正常组织中的表达，因此HPV特异性的TCR-T细胞将能够安全且有效的治疗HPV引发的头颈癌、宫颈癌。TCR-T的细胞治疗方案包括以下几个核心技术难点：1)TCR的选取；2)TCR-T载体的构建；3)TCR-T的制备和回输。在TCR-T载体构建方面，国际上并没有统一的标准。目前已在进行中的TCR-T临床试验采用完整TCRα链和β链的表达载体[2,3]，但是该载体序列较长，在检测TCR是否成功导入T细胞时需使用特殊的多肽-MHC四聚体，会一定程度影响TCR-T的表达和质量监测。最后，现有的TCR-T技术在病人T细胞中直接导入外源TCR，但是未有效限制外源TCR与內源TCR的错配情况。错配将有可能产生非特异性TCR识别，一旦有少量细胞识别自身抗原并克隆增殖，则会造成大规模的自体免疫反应，在临床中会有极大的安全风险。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种单链TCR-T载体及单链TCR-T细胞生产工艺。本专利技术目的之一是这样实现的：一种单链TCR-T载体，其特征在于：(1)含有，但不限于针对HLA-A2呈递的HPV-16E6多肽的单链TCR序列，包括细胞膜定向信号肽序列SEQIDNo.1、TCRα链的可变区Vα序列SEQIDNo.2以及TCRβ链的可变区Vβ序列SEQIDNo.4；(2)含有，但不限于连接TCRVα以及Vβ的连接序列SEQIDNo.3；(4)其中，Vα与Vβ形成的单链TCR删去了可变区中不识别抗原部分；(4)含有，但不限于改造后可以形成二硫键的鼠源恒定区Cβ序列SEQIDNo.5以及恒定区Cα序列SEQIDNo.8；(5)含有，但不限于用于同时表达Cβ和Cα的间隔多肽P2A序列SEQIDNo.6以及Cα部分细胞膜信号肽SEQIDNo.7。其中，鼠源Cβ和Cα可以有效降低TCR-T与人体T细胞中的人源Cβ或者Cα错配，从而减少因错配产生的非HPV特异性TCR；其中，改造后鼠源Cβ和Cα增加一处二硫键配对的半胱氨酸，从而进一步促进导入TCR-T的自配对，降低与人源TCR配对的可能性；其中，鼠源Cβ和Cα含有细胞内信号转导区，在单链TCR识别抗原后可以激活T细胞下游分子通路；该载体含有独立的Cα部分(SEQIDNo.8)，用于支撑整个TCR结构，同时允许仅更换Vα-Vβ-Cβ部分获得识别其它抗原的TCR-T，从而增加该载体构建方案的可扩展性；鼠源Cβ和Cα可用于免疫荧光染色方法检测TCR-T载体的表达强度。本专利技术目的之二是这样实现的：一种TCR-T细胞生产工艺，其特征在于，包括：(1)使用单链TCR-T载体、病毒结构载体共转染逆转录病毒包装细胞系；(2)筛选产生高滴度的单链TCR-T逆转录病毒的单细胞；(3)扩增出稳定并持续生产单链TCR-T逆转录病毒的病毒生产细胞系。鉴于传统TCR-T疗法的局限和不足，本专利技术对TCR-T的设计进行根本性创新。首先，传统TCR-T的TCR识别区被分散在两条肽链上，而本专利技术构建出单链TCR，直接连接TCRα链的可变区Vα序列以及TCRβ链的可变区Vβ序列，极大简化了克隆步骤并加强了表达效率。第二，本专利技术通过使用改造的鼠源的Cβ和Cα，并在这两条肽链上增加了一个二硫键配对位点，极大程度减少了外源导入TCR和內源TCR错配引起的非特异性识别。这一并允许使用通用方法，即检测鼠源Cβ和Cα来检测TCR-T的表达效果。在TCR-T的制备方面，本专利技术涵盖单链TCR-T逆转录病毒生产细胞系的生产工艺，能够稳定快速的制备临床应用级的TCR-T细胞。SEQIDNo.1(HPV16-E6长链信号肽序列)MALEHLLIILWMQLTWVSSEQIDNo.2(HPV16-E6Vα氨基酸序列)GQQLNQSPQSMFIQEGEDVSMNCTSSSIFNTWLWYKQDPGEGPVLLIALYKAGELTSNGRLTAQFGITRKDSFLNISASIPSDVGIYFCAGHPSSNSGYALNFGKGTSLLVTPSEQIDNo.3(单链TCR连接序列)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNo.4(HPV16-E6Vβ氨基酸序列)GAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFSAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCASSSQTGARTDTQYFGPGTRLTVLSEQIDNo.5(改造后增加二硫键的鼠源Cβ氨基酸序列)EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVCATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSSEQIDNo.6(P2A氨基酸序列)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPSEQIDNo.7(HPV16-E6短链信号肽序列)MALPVTALLLPLALLLHAARPSEQIDNo.8(改造后增加二硫键的鼠源Cα氨基酸序列)DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNACYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS有益效果：本专利技术公开了一种新型的TCR-T的构建方案，该方案能有效确保特异性TCR的表达，并通过增强TCR的特异性提高TCR-T疗法的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单链TCR‑T载体，其特征在于：(1)含有，但不限于针对HLA‑A2呈递的HPV‑16E6多肽的单链TCR序列，包括细胞膜定向信号肽序列SEQ ID No.1、TCRα链的可变区Vα序列SEQ ID No.2以及TCRβ链的可变区Vβ序列SEQ ID No.4；(2)含有，但不限于连接TCRVα以及Vβ的连接序列SEQ ID No.3；(3)其中，Vα与Vβ形成的单链TCR删去了可变区中不识别抗原部分；(4)含有，但不限于改造后可以形成二硫键的鼠源恒定区Cβ序列SEQ ID No.5以及恒定区Cα序列SEQ ID No.8；(5)含有，但不限于用于同时表达Cβ和Cα的间隔多肽P2A序列SEQ ID No.6以及Cα部分细胞膜信号肽SEQ ID No.7。
【技术特征摘要】
1.一种单链TCR-T载体，其特征在于：(1)含有，但不限于针对HLA-A2呈递的HPV-16E6多肽的单链TCR序列，包括细胞膜定向信号肽序列SEQIDNo.1、TCRα链的可变区Vα序列SEQIDNo.2以及TCRβ链的可变区Vβ序列SEQIDNo.4；(2)含有，但不限于连接TCRVα以及Vβ的连接序列SEQIDNo.3；(3)其中，Vα与Vβ形成的单链TCR删去了可变区中不识别抗原部分；(4)含有，但不限于改造后可以形成二硫键的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈锐，李思，房晋旭，于海礼，吴海阳，
申请(专利权)人：重庆天科雅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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