一种基于针对特定基因反向互补序列和Py位点调控可变剪切的方法技术

本发明专利技术公布了一种基于针对特定基因反向互补序列和Py位点调控可变剪切的方法。具体是针对特定靶标基因可变剪切外显子上下游内内含子设计反向互补序列，并和Py位点一起构建进质粒中，通过反向互补序列与靶标基因配对，使其靶向定位，并通过Py区招募U2AF65蛋白和其他剪切因子，从而对靶标基因的可变剪切产生调节作用。本发明专利技术的方法可用于制备药物，在治疗由于可变剪切错误引起的人类疾病中有着极为重要的意义。

A method of regulating variable shear based on specific gene reverse complementary sequences and Py loci

The invention has published a method for regulating variable shear based on specific gene reverse complementary sequences and Py loci. Concrete is a specific target gene spliced exon intron downstream within design complementary sequences, and Py sites to build into the plasmid, the complementary sequences of target genes and the pairing, targeting, and through the Py recruitment of U2AF65 proteins and other factors to shear, target gene variable shear regulation. The method of the present invention can be used in the preparation of drugs and is of great significance in the treatment of human diseases caused by variable shear errors.

【技术实现步骤摘要】
一种基于针对特定基因反向互补序列和Py位点调控可变剪切的方法
本专利技术涉及生物学领域，具体地，涉及一种针对特定靶标基因设计其反向互补序列，将其与Py位点一起构建质粒，从而调控靶基因可变剪切的方法。
技术介绍
可变剪切是前体mRNA通过不同的剪切方式，产生不同的剪切异构体的过程。可变剪切可以调节基因表达和蛋白质多样性，是导致真核生物和蛋白质多样化的重要原因。一些重要基因可变剪切的错误调节可以导致人类疾病。真核生物的前体mRNA要通过一定的加工过程才能形成成熟的mRNA。这一过程包括5’端加帽，3’端加尾，以及去除内含子的剪接。成熟的mRNA与其他的蛋白质形成复合物转运出核在细胞质中进行翻译或降解。大多数前体RNA只有一种剪接形式，翻译成一种蛋白质。还有一些前体RNA在不同剪切位点间有好几种剪切形式，形成不同的剪切异构体，翻译成的蛋白质也不止一种，这个过程叫做可变剪切。可以想象的是，这样高效的信息存储方式，出现的错误概率也会增加。而由于可变剪切发生错误而引起的人类疫病，都是非常严重的。据报道，如果把可变剪切的RNA异构体的相对含量改变，可能会引发疾病(Douglas,A.Getal.,2011；Havens,M.Aetal.,2013)。例如，MAPT基因编码的tau蛋白是阿尔兹海默病的致病蛋白，对微管的组装和稳定起到重要的作用。在MAPT基因的10号外显子的调节元件中出现突变，会使得10号外显子的可变剪切降低，这样含有四个微管结合位点的tau蛋白异构体含量所占的比例就会上升，而含有三个微管结合位点的tau蛋白异构体含量所占的比例就会下降，这样会是的tau蛋白增加聚集，从而引起疾病。在剪切和可变剪切中需要多种RNA和蛋白的共同作用，比如U2AF65。Py全称多聚嘧啶区(Polypyrimidinetract)，是一段多嘧啶区，可以通过蛋白U2AF65结合，在剪切过程中起着重要的调节作用。
技术实现思路
为了位点影响特异，本专利技术提供了序列特异性介导可变剪接的一种方法。本专利技术所用的方法，是针对特定靶标基因可变剪切外显子上下游内内含子设计反向互补序列，并和Py位点一起构建进质粒中，通过反向互补序列与靶标基因配对，使其靶向定位，并通过Py区招募U2AF65蛋白和其他剪切因子，从而对靶标基因的可变剪切产生调节作用。这种方法可用于制备药物，在治疗由于可变剪切错误引起的人类疾病中有着极为重要的意义。具体而言，本专利技术涉及以下各项：1.一种用于调控靶标基因剪切的构建体，所述构建体包含Py位点和针对所述靶标基因的反向互补序列。2.根据1所述的构建体，所述反向互补序列是针对所述靶标基因的可变剪切外显子的上/下游内内含子。3.根据1所述的构建体，所述反向互补序列插入在所述Py位点3’端。4.质粒，其包含1-3中任一项所述的构建体。5.一种调控靶标基因剪切的方法，所述方法包括以下步骤：1)将1至3中任一项所述的构建体或4所述的质粒转染入细胞；2)提取RNA；3)检测靶标基因的可变剪接的变化。6.根据5所述的方法，其中，步骤3)中使用RT-PCR的方法检测靶标基因的可变剪接的变化。7.根据1至3中任一项所述的构建体、4所述的质粒或5或6所述的方法，其中所述靶标基因包括P2RX5、HMGCS1、FAM96A、TAZ、PRR3、BTBD10和/或NFIC。8.根据1至3中任一项所述的构建体或4所述的质粒用于制备药物的用途，所述药物用于治疗由于可变剪切错误引起的动物及人类疾病。附图说明图1.不含PY和包含PY质粒示意图。图2a.P2RX5实施例结果示意图。图2b.HMGCS1实施例结果示意图。图2c.FAM96A实施例结果示意图。图2d.TAZ实施例结果示意图。图2e.PRR3实施例结果示意图。图2f.BTBD10实施例结果示意图。图2g.NFIC实施例结果示意图。具体实施方式提供以下实施例以便更好地理解本专利技术，而非限制本专利技术。以下实例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。细胞来源：本实验所用所有细胞均来自中国科学院细胞库，细胞种类分别为：HEK293T(CRL-3216TM)，HeLa(CCL-2TM)。通过构建目标基因上下游内含子中反向互补序列的质粒，在细胞中过表达来影响可变剪接。实施例实施例1、P2RX5的质粒构建增强可变剪接1.构建P2RX5及其对照质粒在原始的含有Py位点(其序列为SEQIDNO.1所示)和不含有Py位点(作为对照)的质粒(其序列为SEQIDNO.2所示)的基础上，在Py位点后插入P2RX5可变剪接外显子上游内含子中的反向互补序列，构建成质粒P2RX5(其序列为SEQIDNO.3所示)和对照质粒△Py-P2RX5(其序列为SEQIDNO.4所示)。质粒示意图如附图1所示。2.利用LipofectAmine2000转染P2RX5和△Py-P2RX5到HEK293T细胞中，48h后收获细胞，用TRIzolRNA抽提试剂(Ambion)抽提RNA，通过RT-PCR的方法检测P2RX5的可变剪接的变化，结果如附图2a所示，增强了可变剪切。实施例2、HMGCS1的质粒构建增强可变剪接1.构建HMGCS1及其对照质粒在原始的含有Py位点(其序列为SEQIDNO.1所示)和不含有Py位点(作为对照)的质粒(其序列为SEQIDNO.2所示)的基础上，在Py位点后插入HMGCS1可变剪接外显子上游内含子中的反向互补序列，构建成质粒HMGCS1(其序列为SEQIDNO.5所示)和对照质粒△Py-HMGCS1(其序列为SEQIDNO.6所示)。2.利用LipofectAmine2000转染HMGCS1和△Py-HMGCS1到HEK293T细胞中，48h后收获细胞，用TRIzolRNA抽提试剂(Ambion)抽提RNA，通过RT-PCR的方法检测HMGCS1的可变剪接的变化，结果如附图2b所示，增强了可变剪切。实施例3、FAM96A的质粒构建增强可变剪接1.构建FAM96A及其对照质粒在原始的含有Py位点(其序列为SEQIDNO.1所示)和不含有Py位点(作为对照)的质粒(其序列为SEQIDNO.2所示)的基础上，在Py位点后插入FAM96A可变剪接外显子上游内含子中的反向互补序列，构建成质粒FAM96A(其序列为SEQIDNO.7所示)和对照质粒△Py-FAM96A(其序列为SEQIDNO.8所示)。2.利用LipofectAmine2000转染FAM96A和△Py-FAM96A到HEK293T细胞中，48h后收获细胞，用TRIzolRNA抽提试剂(Ambion)抽提RNA，通过RT-PCR的方法检测FAM96A的可变剪接的变化，结果如附图2c所示，增强了可变剪切。实施例4、TAZ的质粒构建增强可变剪接1.构建TAZ及其对照质粒在原始的含有Py位点(其序列为SEQIDNO.1所示)和不含有Py位点(作为对照)的质粒(其序列为SEQIDNO.2所示)的基础上，在Py位点后插入TAZ可变剪接外显子上游内含子中的反向互补序列，构建成质粒TAZ(其序列为SEQIDNO.9所示)和对照质粒△Py-TAZ(其序列为SEQIDNO.10所示)。2.利用LipofectA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于调控靶标基因剪切的构建体，所述构建体包含Py位点和针对所述靶标基因的反向互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于调控靶标基因剪切的构建体，所述构建体包含Py位点和针对所述靶标基因的反向互补序列。2.根据权利要求1所述的构建体，所述反向互补序列是针对所述靶标基因的可变剪切外显子的上/下游内内含子。3.根据权利要求1所述的构建体，所述反向互补序列插入在所述Py位点3’端。4.质粒，其包含权利要求1-3中任一项所述的构建体。5.一种调控靶标基因剪切的方法，所述方法包括以下步骤：1)将权利要求1至3中任一项所述的构建体或权利要求4所述的质粒转染入细胞；2)提取RNA；...

【专利技术属性】
技术研发人员：单革，胡珊珊，王小林，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34