一种敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种敲除胶质母细胞瘤细胞DHC2基因的试剂盒，以及该试剂盒的应用，以及一种敲除胶质母细胞瘤细胞的DHC2等位基因的方法。本发明专利技术所述的敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒，包括第一敲除质粒和第二敲除质粒，或者包括第一敲除质粒和第三敲除质粒，或者包括第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒；所述第一敲除质粒能转录出序列为SEQ ID NO:1的第一向导RNA；所述第二敲除质粒能转录出序列为SEQ ID NO:2的第二向导RNA；所述第三敲除质粒能转录出序列为SEQ ID NO:3的第三向导RNA。本发明专利技术首次提供了针对DHC2基因进行稳定敲除的试剂盒，本试剂盒所包含的敲除质粒具备脱靶率低、特异性强的特征；该试剂盒能稳定敲除DHC2两等位基因，基因编辑效率极高。

A kit for knocking the DHC2 gene of glioblastoma

The invention relates to a kit for knocking out DHC2 gene of glioblastoma cell, and the application of the kit, and a method for knocking out DHC2 alleles of glioblastoma cells. The knockout kit of glioblastoma DHC2 gene, including the first knockout plasmid and second knockout plasmid, or comprises a first knockout plasmid and third knockout plasmid, or comprises a first knockout plasmid, second knockout plasmid and third knockout plasmid; the first knockout plasmid it can transcript sequences for the first SEQ ID wizard RNA NO:1; the second knockout plasmid transcribed sequence was second RNA SEQ ID NO:2 wizard; the third knockout plasmid transcribed sequence was third RNA SEQ ID wizard NO:3. The invention provides a kit for knocking out the DHC2 gene for the first time. The knockout plasmid contained in the kit has the characteristics of low miss distance and strong specificity. The kit can knock out DHC2 two alleles stably, and the gene editing efficiency is very high.

【技术实现步骤摘要】
一种敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒
本专利技术涉及一种敲除胶质母细胞瘤细胞DHC2基因的试剂盒，以及该试剂盒的应用，以及一种敲除胶质母细胞瘤细胞的DHC2等位基因的方法。
技术介绍
胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，而所有组织类型的胶质瘤中，又以胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）最为常见、恶性程度最高、预后最差，其中位无进展生存期仅为6.9个月，中位总体生存期仅为14.6个月。尽管胶质瘤研究在基因分析水平取得了巨大进步，分子靶向药物、免疫疗法等在GBM治疗中尚无明显进展。目前国际上治疗胶质瘤依然主要采用最大安全范围的手术全切除，术后辅以规范的同步放化疗，替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）为首选化疗药物。然而，GBM会对TMZ产生治疗抵抗，这是治疗GBM面临的最大困难。GBM对TMZ耐药，最为重要的是O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）介导的DNA修复；此外，许多其他DNA损伤修复途径通过协同作用，修复损伤DNA双链，亦可以导致GBM对TMZ产生抵抗。临床上，有近半数的GBM为MGMT表达阴性，仍会产生诱导性耐药，具体机制尚不清楚。因此，GBM对于TMZ治疗抵抗的具体机制亟待揭示。DHC2（又名DYNC2H1;dyneincytoplasmic2heavychain1）是胞浆动力蛋白的一条重链，一端与货物结合，另一端则可沿着微管运动，将货物逆转运细胞核内。本专利技术人的前期研究发现，DHC2蛋白可以通过逆转运多种DNA损伤修复蛋白进入细胞核，从而导致MGMT阴性GBM发生诱导耐药；这就提示：如果干预DHC2逆转运途径，将同时阻断多种DNA损伤修复途径，达到满意的治疗效果（WangH,FengW,LuY,LiH,XiangW,ChenZ,HeM,ZhaoL,SunX,LeiB,QiS,LiuY.Expressionofdynein,cytoplasmic2,heavychain1(DHC2)associatedwithglioblastomacellresistancetotemozolomide.SciRep.20164;6:28948.）。最新发现的规律成簇间隔短回文重复（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）Crispr/Cas9技术是一个理想的选择。Crispr/Cas9系统是由一个特异性向导RNA（guidingRNA，gRNA）和核酸酶Cas9蛋白构成，gRNA能够识别特异性的DNA序列，向导Cas9蛋白对DNA双链进行剪切，从而达到基因剪切、编辑的效果。与其他一些基因编辑技术相比，该系统具有显著优点：（1）载体构建简单，Cas9蛋白相同，只需设计特异的gRNA；（2）可同时编辑多个特定的靶位点基因；（3）实验周期短，花费低，操作简单，易于推广（CongL,RanFA,CoxD,LinSL,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuXB,JiangWY,MarraffiniLA,ZhangF.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science,2013,339(6121):819–823；MaliP,YangLH,EsveltKM,AachJ,GuellM,DiCarloJE,NorvilleJE,ChurchGM.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science,2013,339(6121):823–826.）。然而，由于所设计的gRNA序列与基因组某段DNA序列可能存在较大的相似性，进而会与非靶点DNA序列发生错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应（Off-targeteffects）。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用（TanEP,LiY,Velasco-HerreraMdelC,YusaK,BradleyA.Off-targetassessmentofCRISPR-Cas9guidingRNAsinhumaniPSandmouseEScells.Genesis.201553(2):225-36.）。因此，针对GBM细胞的DHC2基因，如果按照常规步骤进行操作，工作量大、并且敲除效率极低，有必要开发能有编辑效率高、脱靶效应低的改进的基因编辑方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒，该试剂盒具备编辑效率高、特异性强、脱靶效应低的特点，能高效、稳定地敲除胶质母细胞瘤DHC2基因，从而能够准确对DHC2基因进行沉默表达，显著提高GBM细胞对治疗的反应性，改善胶质母细胞瘤（GBM）病人预后。本专利技术所述的敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒，包括第一敲除质粒和第二敲除质粒，或者包括第一敲除质粒和第三敲除质粒，或者包括第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒；所述第一敲除质粒能转录出序列为SEQIDNO:1的第一向导RNA；所述第二敲除质粒能转录出序列为SEQIDNO:2的第二向导RNA；所述第三敲除质粒能转录出序列为SEQIDNO:3的第三向导RNA。第一向导RNA（gRNA#1）：5’-CGUGUGUCAUCUUCCUUAAA-3’（SEQIDNO:1）；第二向导RNA（gRNA#2）：5’-GCUUCUAGUUCACUCAAAAG-3’（SEQIDNO:2）；第三向导RNA（gRNA#3）：gRNA#3：5’-GAUCCUAAAUAAAAACAGAC-3’（SEQIDNO:3）。根据本专利技术所述的试剂盒的进一步特征，所述第一敲除质粒包括第一寡聚DNA，其正向链序列为SEQIDNO:4，反向链序列为SEQIDNO:5；所述第二敲除质粒包括第二寡聚DNA，其正向链序列为SEQIDNO:6，反向链序列为SEQIDNO:7；所述第三敲除质粒包括第三寡聚DNA，其正向链序列为SEQIDNO:8，反向链序列为SEQIDNO:9。第一寡聚DNA（oligoDNA#1）：正向链：CACCGTTTAAGGAAGATGACACACG（SEQIDNO:4）；反向链：AAACCGTGTGTCATCTTCCTTAAAC（SEQIDNO:5）；第二寡聚DNA（oligoDNA#2）：正向链：CACCGCTTTTGAGTGAACTAGAAGC（SEQIDNO:6）；反向链：AAACGCTTCTAGTTCACTCAAAAGC（SEQIDNO:7）；第三寡聚DNA（oligoDNA#3）：正向链：CACCGTCTGTTTTTATTTAGGATC（SEQIDNO:8）；反向链：AAACGATCCTAAATAAAAACAGAC（SEQIDNO:9）。根据本专利技术所述的试剂盒的进一步特征，所述第一敲除质粒是由所述第一寡聚DNA插入pGK1.1质粒载体所形成的；所述第二敲除质粒是由所述第二寡聚DNA插入pGK1.1质粒载体所形成的；所述第三敲除质粒是由所述第三寡聚DNA插入pGK1.1质粒载体所形成的。本专利技术还提供了所述的试剂盒的应用，即在敲除胶质母细胞瘤细胞以及哺乳动物细胞的DHC2等位基因的应用。本专利技术的另一个目的是提供一种敲除胶质母本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒，其特征在于：包括第一敲除质粒和第二敲除质粒，或者包括第一敲除质粒和第三敲除质粒，或者包括第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒；所述第一敲除质粒能转录出序列为SEQ ID NO:1的第一向导RNA；所述第二敲除质粒能转录出序列为SEQ ID NO:2的第二向导RNA；所述第三敲除质粒能转录出序列为SEQ ID NO:3的第三向导RNA。

【技术特征摘要】
1.一种敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒，其特征在于：包括第一敲除质粒和第二敲除质粒，或者包括第一敲除质粒和第三敲除质粒，或者包括第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒；所述第一敲除质粒能转录出序列为SEQIDNO:1的第一向导RNA；所述第二敲除质粒能转录出序列为SEQIDNO:2的第二向导RNA；所述第三敲除质粒能转录出序列为SEQIDNO:3的第三向导RNA。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第一敲除质粒包括第一寡聚DNA，其正向链序列为SEQIDNO:4，反向链序列为SEQIDNO:5；所述第二敲除质粒包括第二寡聚DNA，其正向链序列为SEQIDNO:6，反向链序列为SEQIDNO:7；所述第三敲除质粒包括第三寡聚DNA，其正向链序列为SEQIDNO:8，反向链序列为SEQIDNO:9。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述第一敲除质粒是由所述第一寡聚DNA插入pGK1.1质粒载体所形成的；所述第二敲除质粒是由所述第二寡聚DNA插入pGK1.1质粒载体所形成的；所述第三敲除质粒是由所述第三寡聚DNA插入pGK1.1质...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚伟，姚夙，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东,44