一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法技术

本发明专利技术涉及一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法。所述方法通过设计并合成能够被CRISPR‑Cpf1识别的特异crRNA序列来引导Cpf1特异地将双链DNA的特定位置切开并生成预设的粘性末端。利用本发明专利技术的方法,可方便、快捷、准确地获得预定的粘性末端，对DNA进行拼接。使用本发明专利技术的方法能够对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。

An in vitro splicing method of DNA based on Cpf1

【技术实现步骤摘要】
一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法。本专利技术方法可以产生预定粘端，并可用于体外DNA无缝拼接。
技术介绍
2010年，J.CraigVenter实验室完成了蕈状支原体“Synthia”的人工构建，掀起了一场合成生物学研究风暴。相对于传统的限制性内切酶酶切-连接酶连接克隆方法，无缝拼接因其不引入额外序列，具有设计方便，兼容性好等多个优点，在合成生物发展过程发挥越来越重要的作用。目前已有的无缝拼接技术主要包括基于TypeIIS限制性内切酶的拼接方法、基于特定碱基修饰的拼接方法和基于同源序列的拼接方法，这些方法的存在极大的方便了DNA的拼接组装，但同时它们都有各自的局限，有待于进一步的改进。GoldenGate利用TypeIIS限制性内切酶切割位点位于识别位点的外部的特点，通过人为设计不同的粘端实现无缝的体外拼接，对于短片段的体外拼接，尤其是短的重复序列拼接非常有效，但在大片段的拼接过程中由于片段内部的酶切位点的限制而使其应用受到限制。USERfusion克隆方法和MASTER(Methylation-assistedtailorableendsrational)Ligation克隆方法很好的避开了GoldenGate的这一限制，但这两种方法在使用过程中因为要合成是含有尿嘧啶或者含有甲基化的引物，因此成本较高。SLIC(SequenceandLigation-IndependentCloning)是一个方便高效的体外拼接方法，因为其仅通过片段两端的同源序列，通过3'-5'外切酶的消化或者特定的化学修饰而形成同源的粘端，不涉及酶切连接过程，因此在设计的时候非常方便，但SLIC克隆在拼接5个以上的片段以及10kb以上片段时要求同源片段长度较长(大于40bp)，而且效率会急剧下降。GibsonAssembly拼接方法在SLIC的基础上进行改造，在体系中引入5'-3'聚合酶以及连接酶，因此拼接的效率提高了很多，可以拼接达100Kb以上的片段。基于酵母重组的酵母体内拼接可以进一步提高拼接片段大小的上限，但与SLIC、Gibson拼接一样，它们都是基于同源序列的拼接，对于存在重复序列的片段拼接无能为力。CRISPR系统是原核生物中与其获得性免疫相关的防御系统，因其可以被改造为基因组编辑以及相关应用而被人们广泛关注[1-3]。Cpf1是typeⅤ类的一员，其在对应的crRNA介导下切割双链DNA，在双链DNA的18位和23位切割DNA，形成5'端突出的粘端[4]。综上所述，本领域需要提供一种高通用性、高特异性、高效地进行体外核酸拼接方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高通用性、高特异性、高效地进行体外核酸拼接方法。本专利技术另一目的在于提供一种在体外简便快速的预定粘端生成的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种核酸构建物(或核酸构建物组合)，所述的核酸构建物包括：(a)第一核酸构建物，所述第一核酸构建物为双链DNA构建物，并且所述第一核酸构建物的序列中含有至少一个式I所示的Cpf1识别切割元件；D1-D2-D3(I)式中，D1为前间区序列邻近基序PAM；D2为长度N2个核苷酸的Cpf1识别区，其中，N2为正整数14、15、16或17；D3为长度为N3个核苷酸的Cpf1切割区，其中，N3为4-10的正整数；以及(b)第二核酸构建物，所述第二核酸构建物为RNA构建物，并且所述第二核酸构建物为结构如式II所示的crRNA元件；R1-R2-R3(II)式中，R1为5'的发夹区；R2为长度M2个核苷酸的、与D2互补的Cpf1识别引导区，其中M2为正整数14、15、16或17；R3为无、或长度为M3个核苷酸的切割定位区，其中M3为1-20的正整数；并且，所述的D3的序列与所述R3的序列是不匹配的。在另一优选例中，所述的“不匹配”指，沿5'-3'方向，D3序列的第一碱基与R3的序列的第一碱基是不互补的。在另一优选例中，所述的“不匹配”指，沿5'-3'方向，D3序列的前P个碱基与R3的序列的前P个碱基是不互补的，其中P为2、3、4、5、6或7。在另一优选例中，所述的核酸构建物，所述的核酸构建物还包括：(c)第三核酸构建物，所述第三核酸构建物为DNA构建物，并且所述第三核酸构建物的序列中含有至少一个式III所示的Cpf1识别切割元件；E1-E2-E3(III)式中，E1为前间区序列邻近基序PAM；E2为长度N2个核苷酸的Cpf1识别区，其中，N2为正整数14、15、16或17；E3为长度为N3个核苷酸的Cpf1切割区，其中，N3为4-10的正整数。在另一优选例中，所述的核酸构建物，所述的构建物还包括：(d)第四核酸构建物，所述第四核酸构建物为RNA构建物，并且所述第四核酸构建物为结构如式IV所示的crRNA元件；S1-S2-S3(IV)式中，S1为5'的发夹区；S2为长度M2个核苷酸的、与E2互补的Cpf1识别引导区，其中M2为正整数14、15、16或17；S3为无、或长度为M3个核苷酸的切割定位区，其中M3为1-20的正整数；并且，所述的E3的序列与所述S3的序列是不匹配的。在另一优选例中，所述的“不匹配”指，沿5'-3'方向，E3序列的第一碱基与S3的序列的第一碱基是不互补的。在另一优选例中，所述的“不匹配”指，沿5'-3'方向，E3序列的前P个碱基与S3的序列的前P个碱基是不互补的，其中P为2、3、4、5、6或7。在另一优选例中，所述的核酸构建物，所述的式I所示的Cpf1识别切割元件与式III所示的Cpf1识别切割元件是相同的；和/或所述的如式II所示的crRNA元件与式IV所示的crRNA元件是相同的。在另一优选例中，所述的核酸构建物，所述的第一核酸构建物中含有2个或多个式I所示的Cpf1识别切割元件；和/或所述的第三核酸构建物中含有2个或多个式III所示的Cpf1识别切割元件。在另一优选例中，所述的第三核酸构建物中含有2个或多个式I所示的Cpf1识别切割元件。在另一优选例中，所述的第一核酸构建物包括表达载体、核酸片段、质粒、染色体片段。在另一优选例中，所述的第三核酸构建物包括核酸片段、质粒。在另一优选例中，所述的第一核酸构建物包括一种或多种第一核酸构建物。在另一优选例中，所述的第三核酸构建物包括一种或多种第三核酸构建物。在另一优选例中，所述的R1的长度为M1个核苷酸，M1为20-32的正整数。在另一优选例中，N2＝M2。在另一优选例中，N2为15、16或17。在另一优选例中，N2为16或17。在另一优选例中，N2为17。在另一优选例中，N3为5-8，较佳地为5-6，更佳地为5。在另一优选例中，所述的式I和式II的结构为5'至3'的结构。在本专利技术的第二方面，提供了一种反应体系，包括：(i)本专利技术第一方面中所述的核酸构建物；和(ii)Cpf1酶。在另一优选例中，所述的反应体系为液态。在另一优选例中，所述的反应体系还包括一种或多种选自下组的组分：(c1)缓冲液；(c2)TaqDNA连接酶；(c3)去磷酸酶FastAP。在本专利技术的第三方面，提供了一种试剂组合，包括：(i)本专利技术第一方面所述的核酸构建物；和(ii)Cpf1酶。在另一优选例中，在所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包括：(a)第一核酸构建物，所述第一核酸构建物为双链DNA构建物，并且所述第一核酸构建物的序列中含有至少一个式I所示的Cpf1识别切割元件；D1‑D2‑D3   (I)式中，D1为前间区序列邻近基序PAM；D2为长度N2个核苷酸的Cpf1识别区，其中，N2为正整数14、15、16或17；D3为长度为N3个核苷酸的Cpf1切割区，其中，N3为4‑10的正整数；以及(b)第二核酸构建物，所述第二核酸构建物为RNA构建物，并且所述所述第二核酸构建物为结构如式II所示的crRNA元件；R1‑R2‑R3   (II)式中，R1为5'的发夹区；R2为长度M2个核苷酸的、与D2互补的Cpf1识别引导区，其中M2为正整数14、15、16或17；R3为无、或长度为M3个核苷酸的切割定位区，其中M3为1‑20的正整数；并且，所述的D3的序列与所述R3的序列是不匹配的。

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包括：(a)第一核酸构建物，所述第一核酸构建物为双链DNA构建物，并且所述第一核酸构建物的序列中含有至少一个式I所示的Cpf1识别切割元件；D1-D2-D3(I)式中，D1为前间区序列邻近基序PAM；D2为长度N2个核苷酸的Cpf1识别区，其中，N2为正整数14、15、16或17；D3为长度为N3个核苷酸的Cpf1切割区，其中，N3为4-10的正整数；以及(b)第二核酸构建物，所述第二核酸构建物为RNA构建物，并且所述所述第二核酸构建物为结构如式II所示的crRNA元件；R1-R2-R3(II)式中，R1为5'的发夹区；R2为长度M2个核苷酸的、与D2互补的Cpf1识别引导区，其中M2为正整数14、15、16或17；R3为无、或长度为M3个核苷酸的切割定位区，其中M3为1-20的正整数；并且，所述的D3的序列与所述R3的序列是不匹配的。2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物还包括：(c)第三核酸构建物，所述第三核酸构建物为DNA构建物，并且所述第三核酸构建物的序列中含有至少一个式III所示的Cpf1识别切割元件；E1-E2-E3(III)式中，E1为前间区序列邻近基序PAM；E2为长度N2个核苷酸的Cpf1识别区，其中，N2为正整数14、15、16或17；E3为长度为N3个核苷酸的Cpf1切割区，其中，N3为4-10的正整数。3.如权利要求2所述的核酸构建物，其特征在于，所述的构建物还包括：(d)第四核酸构建物，所述第四核酸构建物为RNA构建物，并且所述所述第四核酸构建物为结构如式IV所示的crRNA元件；S1-S2-S3(IV)式中，S1为5'的发夹区；S2为长度M2个核苷酸的、与E2互补的Cpf1识别引导区，其中M2为正整数14、15、16或17；S3为无、或长度为M3个核苷酸的切割定位区，其中M3为1-20的正整数；并且，所述的E3的序列与所述S3的序列是不匹配的。4.如权利要求3所述的核酸构建物，其特征在于，所述的式I所示的Cpf1识别切割元件与式III所示的Cpf1识别切割元件是相同的；和/或所述的如式II所示的crRNA元件与式IV所示的crRNA元件是相同的。5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一核酸构建物中含有2个或多个式I所示的Cpf1识别切割元件；和/或所述的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金，雷超，赵国屏，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31