生长和蛋白质生产的解偶联制造技术

本发明专利技术属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明专利技术一般涉及在生产过程中提高细菌宿主细胞的目的蛋白质的表达水平的方法。本发明专利技术特别涉及通过在生产过程中表达抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质来提高细菌宿主细胞表达目的蛋白质的能力。在生产过程中使制造目的蛋白质的细菌宿主细胞的生长解偶联减少(i)代谢负担，(ii)氧需求，(iii)代谢热发展，和(iv)避免由异源蛋白质表达引起的应激反应，由此提高宿主细胞产生目的蛋白质的能力。本发明专利技术还涉及宿主细胞在蛋白质表达、细胞培养技术中的用途，更具体地涉及培养宿主细胞以产生目的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生长和蛋白质生产的解偶联
本专利技术属于重组生物
，特别属于蛋白质表达领域。本专利技术一般涉及在生产过程中提高细菌宿主细胞的目的蛋白质的表达水平的方法。本专利技术特别涉及通过在生产过程中表达抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质来提高细菌宿主细胞表达目的蛋白质的能力。在生产过程中使制造目的蛋白质的细菌宿主细胞的生长解偶联减少(i)代谢负担，(ii)氧需求，(iii)代谢热发展，和(iv)避免由异源蛋白质表达引起的应激反应，由此提高宿主细胞产生目的蛋白质的能力。本专利技术还涉及宿主细胞用于蛋白质表达、细胞培养技术的用途，更具体地涉及培养宿主细胞以生产目的蛋白质。
技术介绍
用许多原核宿主已经成功生产出目的蛋白质(POI)。最突出的例子是细菌，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。虽然一些蛋白质的生产已容易地实现高收率，但其它许多蛋白质的生产水平仍相对很低。在过去十年中已经生产了大量生物药物(例如抗体或其功能性片段)，而且越来越多接近被批准用于人体，但是生物药物的高效生产依然是一项具有挑战性的任务。每次给药的治疗活性剂量通常为毫克(mg)级。因此，作为活性成分需要相当数量的蛋白质，使得有效率和节约成本的生产有价值。细菌细胞表达系统长期以来一直且目前仍是用于生产这些类型分子的主要工具之一。过程优化的关键目标是以尽可能低的成本获得高产量的具有所要求质量的产品，其通常由特定的表达构建体或系统的特性决定。例如，重组蛋白的高水平表达可能抑制宿主细胞的代谢能力，从而导致质粒损失、氧转移减少、毒副产物的产生、包涵体的形成、和/或触发经常损害有效的蛋白质生产的应激反应。还已知有时编码目的蛋白质的mRNA的高表达不一定带来蛋白质的高量。科学家已经采取了不同的方法来解决这些问题。例如，通过优化编码目的蛋白质的基因剂量，通过使用合适的启动子，或者根据所用宿主细胞通过优化编码目的蛋白质的基因的密码子使用，可以进一步提高重组蛋白的表达。其它几种参数也显示会影响宿主细胞中重组蛋白的表达水平，例如表达载体设计、培养基组成、生长温度、伴侣共表达、mRNA稳定性、翻译起始和表观遗传过程。然而，宿主细胞中蛋白质的高水平生产可能受限于一个或多个不同步骤，如折叠、二硫键形成、糖基化、细胞内转运或从细胞释放。所涉及的许多机制尚未完全了解，即使可得到宿主生物体的整个基因组的DNA序列，也不能基于现有技术的现有知识进行预测。在宿主细胞中生产蛋白质的另一个问题是这种蛋白质对宿主细胞的潜在毒性。因此，发展出了所谓的静止细胞(Q细胞)的概念(WO2007/071959)。在Q细胞中，可以关闭正常的允许产生有毒蛋白质的细胞机制。为了关闭Q-细胞，必须加入吲哚。然而，对于一些应用来说，吲哚可能是不期望的。另一个将宿主细胞的生产机构朝向生产目的蛋白质转变的概念是大肠杆菌中的单一蛋白质生产(SSP)系统。表达所谓的mRNA干扰酶，其在ACA核苷酸序列处切割RNA，而编码目的蛋白质的mRNA缺少ACA碱基三联体(Suzuki等人，(2007)，NatureProtocols2(7)，1802-1810)。引导宿主细胞的代谢能力朝向产生重组蛋白而不是生长的另一种选择是利用RNA干扰引起细胞周期停滞并因此将代谢通量引导朝向产物形成(Ghosh等人，(2012)，MicrobialCellFactory11：93)。鉴于现有技术中关于以合理量生产蛋白质(也包括在宿主细胞中的潜在毒性蛋白质)存在的各种问题，尽管在过去几年中已经得到许多优势，仍然需要识别和开发另外的/替代的方法来改善宿主细胞产生大量重组蛋白质包括潜在毒性蛋白质的能力。因此，本专利技术的技术问题是符合这一需求的。
技术实现思路
作为上述技术问题的解决方案，本专利技术提供了提高宿主细胞中重组蛋白质产量的新手段和新方法，该新手段和新方法简单有效，适用于工业方法中。这些手段和方法在本文中描述，在实施例中说明，并在权利要求中反映。特别地，本专利技术人发现了一种新的将宿主细胞的生长与生产目的蛋白质解偶联的分子机制。由其增殖和同时表达异源蛋白质带给宿主细胞的双重负担降低了目的蛋白质的产量。事实上，宿主细胞在生产目的蛋白质期间的增殖造成宿主细胞的过负荷，导致细胞资源分配的冲突。由此，引发了诸如产生有毒副产物、降低氧转移和诱发应激反应等多种不希望的副作用，最终导致限制转录和翻译以及可能导致细胞死亡的细胞代谢重新定向。鉴于细胞合成能力是异源蛋白质表达的基础，必须考虑宿主细胞的能力。为了减少或消除异源蛋白质表达的不利的副作用，本专利技术人开发了一种表达系统，其将目的蛋白质的生产与宿主细胞的增殖解偶联，由此显著降低宿主细胞的负荷，提高目的蛋白质的产量。更具体地，本专利技术人通过设计包含在诱导型启动子控制下的抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质的宿主细胞，利用抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质。这允许当达到所需的细胞密度时，在生产过程中随意关闭宿主细胞增殖，同时只要所需资源存在就保持宿主细胞生产目的蛋白质的能力。于是，氧消耗、营养需求和代谢热发展被减少，应激反应被避免，因此可得到足够的资源用于生产目的蛋白质。异源蛋白质表达的另外一个问题是目的蛋白质掺入包涵体，导致溶解度和产量降低。这种作用可以如由Vernet等人所示的(2010，ProteinExpressionandPurification，Vol.77，Issue1：104-111)通过减少细胞增殖和降低诱导温度来避免，也因此可以通过本专利技术的生长解偶联生产系统来避免。本专利技术人已经发现抑制细胞生长的噬菌体蛋白可用于使宿主细胞的生长和所述宿主细胞生产目的蛋白质解偶联。事实上，噬菌体蛋白质理想地使宿主细胞中止，而对所述噬菌体蛋白不敏感的表达系统则可以理想地充分利用中止的宿主细胞的蛋白质生产机构。例如，在感染后，噬菌体T7利用其gpo.7和Gp2蛋白关闭大肠杆菌RNA聚合酶。在细菌启动子控制下的噬菌体T7的早期病毒I类基因，例如对在T7启动子控制下的病毒基因具有高度特异性的T7RNA聚合酶，在感染之后立即表达。Gp0.7即所述I类基因，其尤其磷酸化大肠杆菌RNA聚合酶，导致早期基因转录终止，并且从宿主转向病毒RNA聚合酶。随后，病毒基因Gp2被表达，结合并进一步抑制宿主RNA聚合酶的β亚基。Gp0.7和/或Gp2一起抑制大肠杆菌RNA聚合酶，并且由此抑制细胞增殖，导致细菌蛋白质合成机构接管用于病毒目的。通过Gp2抑制大肠杆菌RNA聚合酶由Studier和Moffat示出(1986，J.Mol.Biol.，189，133-130)，但他们没有揭示对细胞增殖的影响。然而，除了Gp0.7和Gp2之外，还有其它这样的噬菌体蛋白质，并且已被本专利技术人用来显示他们这样的概念：使用噬菌体蛋白质，通过使用对这种噬菌体蛋白不敏感的表达系统，使宿主细胞生长与其生产目的蛋白质的能力解偶联。其它这样的噬菌体蛋白质是，例如Nun、Gp6、Gp8或A*，芽孢杆菌(Bacillus)噬菌体SPO1GP40本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞(i)包含在诱导型启动子控制下的编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列；和(ii)包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列；和(iii)包含在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码目的蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.16 EP 15190078.4;2015.04.30 LU 927051.一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞(i)包含在诱导型启动子控制下的编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列；和(ii)包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列；和(iii)包含在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码目的蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的细菌宿主细胞，其特征在于，生长通过抑制转录、DNA复制和/或细胞分裂而被抑制。3.根据权利要求1或2所述的细菌宿主细胞，其特征在于，所述噬菌体蛋白质是(i)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有SeqIdNo：1所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与SeqIdNo：1所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；(ii)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有SeqIdNo：2所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与SeqIdNo：2所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；(iii)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有SeqIdNo：3所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与SeqIdNo：3所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；(iv)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有SeqIdNo：4所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与SeqIdNo：4所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；(v)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有SeqIdNo：5所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与SeqIdNo：5所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；或者(vi)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有SeqIdNo：6所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与SeqIdNo：6所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；(vii)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有SeqIdNo：7所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与SeqIdNo：7所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；(viii)引起宿主转录关闭的蛋白质，其中所述蛋白质是(a)引起宿主转录关闭的具有SeqIdNo：8、9、10、11、12、13或14所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者(b)引起宿主转录关闭的具有与SeqIdNo：8、9、10、11、12、13或14所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质。4.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其特征在于，编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的所述核苷酸序列、编码所述RNA聚合酶的所述核苷酸序列、编码目的蛋白质的所述核苷酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中或由染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·迈尔霍费尔，G·施特里德纳，R·格拉布赫尔，M·王尔德，
申请(专利权)人：恩格内斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT