本发明专利技术涉及一种获得子宫颈涂片中癌症及其癌前期的改进诊断的自动化方法，所述的方法使用抗体或核酸探针、通过同时染色和检测细胞中至少两种不同的分子标记物来进行，所述的分子标记物在基因表达中表现出与疾病相关的变化。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
癌性疾病仍然是全球最常见的致死原因之一。临床上需要癌症和癌前期的早期识别和特定检测方法，以便通过早期治疗性干预预防肿瘤恶化。因此，自二十世纪五十年代开始业已为多种癌症(特别是子宫颈、乳腺和肠)提供了预防程序，许多国家利用这些程序已经使死亡率降低。在妇女宫颈癌的情况中，医疗检查主要是基于取自子宫颈的细胞涂片的形态/细胞学检查，即它被称作PAP试验。然而，这种试验只具有有限的灵敏度(最高达40％错误阴性诊断，Duggan等；1998，EurJ Gynaecol Oncol；19209-214；Bishop等，1996，Buss Pan AmHealth Organ，30，378-86)。而且，最多达10％的涂片被划分为ASCUS(未确定意义的非典型鳞状细胞)，也就是无法明确地将其归类为正常、中等或严重的损伤或肿瘤。但是，经验显示至多10％的这种ASCUS群会由真性损伤构成，由此也被忽视(Manos等，1999，JAMA，281，1605-1610)。如果发现了异常细胞，会进行附加诊断程序，例如阴道窥器检查或取活组织检查，这样可以利用这些方法的结果达到更加准确的诊断并在治疗上作出决定，例如手术摘除病变区域或激光疗法。近年来业已鉴定了大量的基因，作为突变的结果，它们导致其蛋白的表达发生改变，并由此在癌症的恶化中发挥作用。在血清和细胞水平均可以检测出作为诊断标记物的相应蛋白质。所述的蛋白质参与细胞的生理调节过程，例如生长调控(增殖基因，例如Ki67和mcm-5；致癌基因和肿瘤抑制基因，例如p16、EGF受体、her2/neu和mdm-2)、细胞凋亡(自然细胞死亡，例如p53和bcl-2)、DNA修复(msh-1)和细胞粘着(E-钙粘着蛋白、β-连环蛋白和APC)。检测标记物的适宜方法的实例为免疫组织化学和免疫细胞化学检测法，其利用了对抗上述蛋白的特异性抗体(van Noorden，1986，Immunocytochemistry，Modern Methods and Applications，2ndedition，Wright，Bristol，26-53)。此外，在某些癌症类型中，病毒的出现明显与癌症的恶化有关。病毒DNA可以通过杂交方法检测，而且也可以充当诊断标记物，譬如当检测子宫颈涂片中的人乳头状瘤病毒(检测试剂盒可以得自多个供应商，例如Digene、DAKO、BioGenex和ENZO)时。在许多场合下已经显露出，单一标记物不足以特异性地识别病变细胞，因为它也部分存在于健康细胞中。这是基于标记物也是参与健康细胞生理调节过程的蛋白质的事实。因此，例如，虽然例如事实上可以在所有宫颈肿瘤中检测到HPV，但在许多正常宫颈上皮中也可以检测到HPV；也就是，虽然检测HPV的试验非常敏感，但它只具有低的特异性(例如Cuzick，2000，JAMA.283，108-109)。Williams等(1998，PNAS，95，14932-14937)描述了DNA复制标记物mcm-5，其检测出子宫颈的28种试验损伤/肿瘤(n＝58)，但在这28种正常涂片中也提供2种错误的阳性染色。Sano等(Pathology Intl.，1998，48，580-585)报导了标记物p16在15种正常宫颈活组织中的3种非特异染色。在细胞学/病理学中，人们对检测生物样本中多种标记物日益感兴趣。一方面，这能够获得更多可利用的信息；另一方面，用各种标记物获得的非特异染色可以更加容易地识别出它们是什么。传统上，出于这种目的制备了可用活组织的连续切片或机体样本的重复标本(例如宫颈涂片在固定剂中)，随后其分别用特定标记物染色。这种方法存在若干缺点事实上它消耗大量的患者样本材料和染色试剂，而样本材料通常是有限的，染色试剂需要大量的时间并且昂贵，事实上也不可能在细胞中同时清晰地探测出两种或多种标记物。虽然文献中业已报导了在生物样本中两种或多种不同生物标记物的同时检测(DAKO，免疫酶双染色法实际指南；Gomez等，Eur J.Histochem.，1997.41，255-259)，但该途径至今无法应用到常规诊断中。Terhavauta等人(Cytopathology，1994，5.282-293)采用p53和Ki67在取自子宫颈损伤的活组织上的双重染色，并且在一个细胞的某些情况中可以由HPV阳性和HPV阴性损伤衍生的基细胞和副基细胞中检测出这两种标记物。上述双重染色是在子宫颈活组织上进行，但无法转移到宫颈涂片上。以同样的方式，含有很少基和副基细胞的涂片的细胞组成不同于活组织的细胞组成。根据我们的发现，当对子宫颈涂片应用上述标记物联合物时，无法获得任何诊断上可利用的结果。此外，作者没有利用有上述双重染色所获得的信息，通过结合所得的结果来达到更加准确的有关这个样本中肿瘤细胞存在的结论。Rao等(1998，Cancer Epidemiology，Biomarkers andEvolution.7，1027-1033)描述了不同肿瘤相关性标记物(DNA含量、G肌动蛋白和p53)在得自乳腺组织的针穿刺材料(FNA，细针针吸活检)中的多重染色。他们解释了其使用多种标记物得到比由单独标记物的观察更加高的临床特异性的结果，并由此在乳腺癌的早期识别中发挥重要作用。作者所引用的多重染色仅限于由乳腺组织获得的针穿刺材料。他们不曾尝试从肿瘤区域的检测自动化的立场上利用这些染色信息。此外，所述的染色法无法适用于其他生物材料(即活组织和子宫颈涂片)，因为物质的性质不同。自动化现有临床肿瘤诊断的进一步改进在于两个方面，一方面是样本制备和染色的自动化，另一方面是自动图形分析，自动图形分析中包括诊断的确立。除了节省时间和人力以外，这样也可以更加客观，并由此使诊断更加统一。使用荧光或生色染料在肿瘤细胞或其前体中的生物标记物的染色能够做到定量，并且由此自动读取信号。尽管没有通过图象分析的方式自动诊断，但能够自动实施染色方案的体系业已存在(LeNeel等，1998.Clin Chim Acta，278，185-192)。最先进的体系是利用形态学图象信息自动化检测子宫颈涂片中的肿瘤细胞及其前体(Saways等，1999，Clinical Obstetrics and Gynaecology，42，922-928Stoler，2000 Mod.Pathol，13，275-284)。除了利用PAPNET体系自动化形态检测子宫颈涂片中的异常细胞以外，Boon等(1995，Diagn.Cytopathol，13，423-428)也用Ki67抗体对增殖细胞进行免疫组织化学染色。然而，这种单一分子标记物的使用无法明确地区分良性增殖细胞和癌细胞。Boon等的专利(US-5544650)报告了用免疫化学标记物的染色有利于样本中增殖(癌性和非癌性)细胞的自动化检测，并且在半自动过程中，监控病理学家/细胞学家随后可以判断被染色细胞实际上是否为癌细胞。专利US-6005256(其作者为McGlynn和Akkapeddi)详细描述了同时检测机体样本中多种荧光标记的标记物的装置和方法，以及用于鉴定癌细胞的装置和方法，但并没有实施到癌症诊断的具体应用中或指出适当的标记物联合物可以产生较高的特异性。已知A本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测子宫颈涂片中的肿瘤细胞及其前体的方法，该方法通过同时检测细胞中至少两种分子标记物来进行。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G亨尼格，R维尔茨，M多斯，K波曼，S翁格尔，
申请(专利权)人：拜尔公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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