Y染色体复合扩增银染试剂盒制造技术

一种Ｙ染色体复合扩增银染试剂盒，其特征是由分离包装的短引物ＹＰＡ、短引物ＹＰＢ、缓冲液（无Ｍｇｃｌ＃－［２］）、ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇｃｌ＃－［２］、Ａ基因座长引物ＹＰＡ－Ａ－Ｐ＃－［１］和Ａ基因座长引物ＹＰＢ－Ａ－Ｐ２、Ｂ基因座长引物ＹＰＡ－Ｂ－Ｐ１和Ｂ基因座长引物ＹＰＢ－Ｂ－Ｐ２、Ｃ基因座长引物ＹＰＡ－Ｃ－Ｐ１和Ｃ基因座长引物ＹＰＢ－Ｃ－Ｐ２、Ｄ基因座长引物ＹＰＡ－Ｄ－Ｐ１和Ｄ基因座长引物ＹＰＢ－Ｄ－Ｐ２以及人工等位基因分型标准物构成。本发明专利技术对试剂盒内的引物进行了设计，从而能够高效率地同时对Ｙ染色体上的任意四个ＳＴＲ基因座进行复合扩增，并可以方便地采用硝酸银染色方式检测扩增结果，对实验设备的成本要求不高，符合当前中国大多数分子生物学实验室的需要，具有中国特色。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于体外一次性扩增Y染色体上的多个DNA目的片段的试剂盒。
技术介绍
人体的23对染色体中，决定性别的染色体叫做性染色体。性染色体分为X、Y两种。Y染色体是男性特有的，男性有带X、Y两种染色体的精子，女性只有带X染色体的卵子。当带Y染色体的精子与X染色体的卵子相结合受孕，产生的个体就是男性；而带X染色体的精子与带X染色体的卵子相结合，产生的个体则是女性。所以Y染色体只能由男性遗传，Y染色体的遗传标记也就随父系代代相传。与常染色体相比，Y染色体上的遗传标记不存在重组与交换。Y染色体遗传标记的特点可以运用到刑事案件的侦破上。对于个人识别的优点在于1.对阴道分泌物与精液构成的混合斑，分析Y染色体遗传标记可以不受女性成份的干扰。阴道分泌物与精液构成的混合斑痕(以下简称混合斑)是性犯罪案件最常见的法医物证检材。混合斑由两个人甚至多个人的体液构成，混合斑中阴道分泌物的量远远高于精液成份。国内外DNA实验室采用的遗传标记大多定位于常染色体，用常染色体DNA遗传标记分型时，大量阴道分泌物成份常常干扰和掩盖对精液成份的检测。因此，混合斑的个人识别是法医学迫切需要解决的难题。相比之下，检测Y染色体特异遗传标记时，由于阴道脱落上皮细胞不含这类遗传标记，阴道脱落上皮细胞含量多少将不会影响检测结果。更重要的是，Y染色体特异遗传标记可实现仅对精液成份分型，结果可与犯罪嫌疑人直接比较，解释结果更为简单。2.用Y染色体遗传标记检测轮奸案的混合斑，可推知罪犯的最少人数，为侦察提供线索。3.男性嫌疑人在逃的案件，可利用嫌疑人父系亲属的DNA进行Y染色体遗传标记分析。Y染色体遗传标记对于亲权鉴定的优点在于1.父亲已死亡或失踪，可通过父系亲属Y染色体遗传标记进行父权鉴定2.可对兄弟、叔侄及爷孙隔代关系进行鉴定。然而，人类Y染色体非重组区遗传标记很少，这是Y染色体遗传标记未能广泛应用的主要原因。所幸的是，“人类基因组计划”研究中发现了一类具有Y染色体特异性的DNA短串联重复序列(以下简称Y染色体特异STR基因座)，为法医学个人识别与亲权鉴定带来了新的希望，可以提供新的技术解决方案和新的检测手段。认识到Y染色体特异STR基因座的重要性，1996年和2000年在德国柏林分别召开了第一届和第二届国际法医Y染色体特异STR基因座分型协调会议。目前，Y染色体特异STR基因座是美国及欧洲国家法医学研究的重点之一。然而，与常染色体相比，极少有Y染色体特异STR基因座分型的商品试剂出现。原因在于Y染色体的结构中，长臂DNA有大量大片段重复，要求PCR反应条件比常染色体高得多；用对常染色体的方法进行Y染色体特异STR复合扩增极为困难。另一方面，除拟常染区外，Y染色体非重组区中的某些基因座与X染色体仍有部分同源序列，这些基因座在一定的PCR反应条件下不具男性特异性，进一步增加了设计Y染色体特异STR复合扩增体系的难度。聚合酶链式反应(PCR)技术是目前常用体外DNA扩增技术。在PCR反应时，首先需要一段长约17-20余个碱基的寡核苷酸片段作为引物(primer)，该引物是按照欲检测的DNA片段的两个5′端的碱基顺序合成的，PCR扩增的特异性取决于引物与模板的特异结合。整个扩增过程分三步(1)变性加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；(2)退火突然变温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单等特点，主要的结合发生在模板与引物之间；(3)延伸在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。上述三步为一循环，从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后DNA可扩增2n-2n倍。目前国内外实验室对Y染色体STR遗传标记所采用的最主要的方法还是对其单个STR基因座进行PCR扩增，例如我们实验室侯一平等人在《ForensicScience Internetional》2001年第118(2-3)期中发表的《Allele sequencesof six new Y-STR loci and haplotypes in the Chinese Han population》文章中所介绍的方法。单个Y染色体STR基因座扩增较多个Y染色体STR基因座同时扩增(复合扩增)容易，条件较简单。但是，复合扩增有着单个基因座扩增所不具备的优势，一次能同时能同时扩增多个基因座，省时、经济。所以Y染色体STR基因座的复合扩增一直是国内外相关实验室研究的重点。目前，国内外对于Y染色体STR基因座的复合扩增的研究一直处于探索之中，虽然国外已有Y染色体STR基因座的试剂盒出售使用，但它们是基于荧光检测为基础的，即采用荧光标记引物、通过DNA自动测序仪进通过自动测序仪进行检测的方式。例如，Bulter JM等在《Forensic Science Internetional》2002年第129(1)期中发表的《A novel multiplex for simultaneousamplification of 20 Y chromosome STR markers》文章中所介绍的即是这种方法。而我们的试剂盒的检测原理与他们不同，我们是以银染法为基础设计的。他们检测的是DNA的单链结构(标记荧光的链)，而我们检测的是DNA的双链结构，目前国内外尚未报道相关技术与产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可同时扩增四个基因座、扩增效率高、便于实验室操作和便于检测扩增效果的Y染色体复合扩增银染试剂盒。本专利技术的Y染色体复合扩增银染试剂盒由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型标准物构成，其中短引物YPA为非人类的基因组序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB为非人类的基因组序列 (5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)；A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2为分别在能够与人类的A基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2为分别在能够与人类的B基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2为分别在能够与人类的C基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2为分别在能够与人类的D基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｙ染色体复合扩增银染试剂盒，其特征是由分离包装的短引物ＹＰＡ、短引物ＹＰＢ、缓冲液（无Ｍｇｃｌ↓［２］）、ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇｃｌ↓［２］、Ａ基因座长引物ＹＰＡ－Ａ－Ｐ１和Ａ基因座长引物ＹＰＢ－Ａ－Ｐ２、Ｂ基因座长引物ＹＰＡ－Ｂ－Ｐ１和Ｂ基因座长引物ＹＰＢ－Ｂ－Ｐ２、Ｃ基因座长引物ＹＰＡ－Ｃ－Ｐ１和Ｃ基因座长引物ＹＰＢ－Ｃ－Ｐ２、Ｄ基因座长引物ＹＰＡ－Ｄ－Ｐ１和Ｄ基因座长引物ＹＰＢ－Ｄ－Ｐ２以及人工等位基因分型标准物构成，其中：短引物ＹＰＡ、ＹＰＢ为非人类的基因组序列： ＹＰＡ：５′－－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′；ＹＰＢ：５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′；Ａ基因座长引物ＹＰＡ－Ａ－Ｐ１和Ａ基因座长引物ＹＰＢ－Ａ－Ｐ２为分别在能够与人类的Ａ基 因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上所述短引物ＹＰＡ、ＹＰＢ而得到的基因组序列；Ｂ基因座长引物ＹＰＡ－Ｂ－Ｐ１和Ｂ基因座长引物ＹＰＢ－Ｂ－Ｐ２为分别在能够与人类的Ｂ基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物Ｐ１ 、Ｐ２的５′端加上所述短引物ＹＰＡ、ＹＰＢ而得到的基因组序列；Ｃ基因座长引物ＹＰＡ－Ｃ－Ｐ１和Ｃ基因座长引物ＹＰＢ－Ｃ－Ｐ２为分别在能够与人类的Ｃ基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上所述短引物ＹＰＡ、ＹＰＢ而 得到的基因组序列；Ｄ基因座长引物ＹＰＡ－Ｄ－Ｐ１和Ｄ基因座长引物ＹＰＢ－Ｄ－Ｐ２为分别在能够与人类的Ｄ基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上所述短引物ＹＰＡ、ＹＰＢ而得到的基因组序列；人工等位基因分型标准物 共包括了Ａ基因座分型标准物、Ｂ基因座分型标准物、Ｃ基因座分型标准物和Ｄ基因座分型标准物；Ａ基因座分型标准物为Ａ基因座的长引物ＹＰＡ－Ａ－Ｐ１、ＹＰＢ－Ａ－Ｐ２经聚合酶链式反应所得产物，且长引物ＹＰＡ－Ａ－Ｐ１、ＹＰＢ－Ａ－Ｐ２经ＰＣＲ扩 增所得产物各占其总重量的二分之一；Ｂ基因座分型标准物为Ｂ基因座的长引物ＹＰＡ－Ｂ－Ｐ１、ＹＰＢ－Ｂ－Ｐ２经聚合酶链式反应所得产物，且长引物ＹＰＡ－Ｂ－Ｐ１、ＹＰＢ－Ｂ－Ｐ２经ＰＣＲ扩增所得产物各占其总重量的二分之一；Ｃ基因座分型标准 物为Ｃ基因座的长引物ＹＰＡ－Ｃ－Ｐ１、ＹＰＢ－Ｃ－Ｐ２经聚合酶链式反应所得产物，且长引物ＹＰＡ－Ｃ－Ｐ１、ＹＰＢ－Ｃ－Ｐ２经Ｐ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯一平，李英碧，应斌武，冀强，董建国，吴谨，张霁，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]