基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法技术

一种基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，采用发卡形探针基因芯片，其步骤包括： １）制作该基因芯片与标靶的电位扫描解链荧光标准曲线 １－１）用已知是完全匹配的样品配制标准溶液； １－２）将标准溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交； １－３）在待测标准溶液中加入嵌入式荧光染料； １－４）对芯片基底施加电位和进行电位扫描； １－５）记录电位扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即为该芯片的电位扫描解链荧光标准曲线； ２）制作该基因芯片与待测样品的电位扫描解链荧光曲线 ２－１）将与标准溶液浓度接近的待测样品ＤＮＡ溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并在溶液中加入嵌入式荧光染料； ２－２）以与获得标准曲线相同的扫描速度对芯片基底施加电位和进行电位扫描； ２－３）记录电位扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即待测样品的电位扫描解链荧光曲线； ３）将待测样品曲线与标准曲线进行比较，给出识别结果 ３－１）计算待测样品曲线与标准曲线的的解链半高电位之差ΔＥ↓［１／２］值； ３－２）当ΔＥ↓［１／２］＜０．２伏时，确认待测样品为标靶； 当ΔＥ↓［１／２］＞０．２伏时，确认待测样品为错靶。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及利用一种基因芯片进行生物分子检测的方法。
技术介绍
人类基因组计划和其他基因测序计划的完成，蛋白质组计划的实施，为与生命、医学相关的研究，如基因工程、疾病的诊断和治疗、新药的开发，奠定了基础。为了这些后续的工作，同时需要发展新的生物技术，基因芯片就是其中的一个例子。基因芯片的目的是高通量地从大量的DNA或DNA片段中识别出特定的DNA序列和分子。基因芯片的一种类型是将已知的一定序列的DNA片段(以下称作探针)固化在表面上，通过DNA杂交实验，使被测样品中与探针完全匹配的生物分子(以下称作标靶)与探针结合，同时与探针不完全匹配的生物分子(以下简称错靶)不能与探针结合，从而实现对不同生物分子的特异性识别，标靶和错靶统称为样品。在基因芯片检测中，如何将只是一个碱基有差别的两个寡聚核酸序列(即所谓单碱基多态性，SNP)区别开，是一个技术难题。利用温度、pH、盐浓度等来控制或优化DNA杂交是经典的方法。最近，有人专利技术了温度控制的基因芯片，探针为线性DNA分子。但是，线性SNP序列随温度变化的差别较小，信号的区别度仍然不能令人满意。利用电位调节、控制生物分子的分析、分离过程，也是经典的方法，大量商品化的分析、分离仪器(如电泳仪)是建立在电位控制上的。以上的电位控制方法都已经被标准化，并被写入有关的教科书。例如卢圣栋主编《现代分子生物学实验技术》(中国协和医科大学出版社，1999年版)。近年来有人提出利用一定电位下产生的电流实现生物分子的导向和双链DNA的解聚和SNP识别，以及在固定电位下识别完全匹配与有两个碱基错配的序列。但是，他们使用的探针都是线性DNA分子，并且都是利用信号强度随时间变化的性质来观测DNA杂交结果。另一方面，无标记荧光检测方法已经是文献中的方法。这一方法利用一类称为嵌入式荧光染料的分子可以与DNA双螺旋结合发出荧光的性质，显示DNA杂交后双螺旋的存在。例如PicoGreen分子就是人们熟知的该类分子。中国专利申请“发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法”(申请号02116202.2，申请日2002年3月22日)公开了一种发卡形探针基因芯片。将发卡结构的探针和无标记荧光检测的方法结合，利用电位扫描，通过荧光强度随电位变化的曲线特征实现SNP识别的技术和方法还没有文章或专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过电位扫描、进行无标记荧光检测的、实现SNP识别的基因芯片检测方法。本专利技术的方法采用发卡形探针基因芯片，其步骤包括1、制作该基因芯片与标靶的电位扫描解链荧光标准曲线1)用已知是完全匹配的样品(标靶)配制溶液(以下称标准溶液)，标准溶液的浓度在1×10-9M和1×10-6M之间，推荐值为5×10-8M。将标准溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交；2)按照生产商提供的使用方法，在待测标准溶液中加入嵌入式荧光染料；3)对芯片基底施加电位和进行电位扫描，最大扫描范围从+0.5V到-1.5V。记录电位扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即为该芯片的电位扫描解链荧光标准曲线。2、制作该基因芯片与待测样品的电位扫描解链荧光曲线1)将与标准溶液浓度接近的待测样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并按照生产商提供的使用方法加入嵌入式荧光染料；2)以与获得标准曲线相同的扫描速度对芯片基底施加电位和进行电位扫描，最大扫描范围是从+0.5V到-1.5V。记录电位扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即待测样品的电位扫描解链荧光曲线。3、将待测样品曲线与标准曲线进行比较，给出识别结果1)计算待测样品曲线与标准曲线的的解链半高电位之差ΔE1/2值；2)当ΔE1/2＜0.2伏时，确认待测样品为标靶；当ΔE1/2＞0.2伏时，确认待测样品为错靶。本专利技术识别错靶判据的理论依据如下由于标靶与发卡形探针形成的双螺旋结构最稳定，荧光信号在较大的电位范围内保持不变，称为高平台区，高平台区的荧光信号强度记为I1，然后在很小的电位区间内荧光信号降低到低平台区，其荧光信号强度记为I2。与之对比，由于错靶与发卡形探针形成的双螺旋结构不够稳定，荧光信号比标靶提前从高平台区降低到低平台区。分别将标靶和错靶的信号降低到I1/2＝(I1-I2)/2+I2时的电位称为标靶和错靶的解链半高电位，E1/2。根据电化学理论，电荷处于电位E下的标准摩尔自由能(G)为G＝G0+δFE(1)其中G0为没有电位时的标准摩尔自由能，δ为分子的有效电荷，F为法拉第常数。而DNA双链的解链平衡常数为=exp(-ΔGRT+lnco)---(2)]]>其中，为表面上未结合样品的发卡形探针的浓度，为表面上与样品结合的发卡形探针的浓度，为溶液中样品的浓度，c0为浓度单位。由以上两式推导可得荧光信号随电位变化的关系为I=I0exp(-δFRT(E-E1/2))1+exp(-δFRT(E-E1/2))---(3)]]>上式便是识别时荧光随电位的关系式，由它拟合实验曲线便可得到解链半高电位。而由(1)、(2)得知，标靶与错靶的解链半高电位之差，ΔE1/2＝|E1/2(标靶)-E1/2(错靶)|，为ΔE1/2=ΔG0δF]]>其中ΔG0为单个碱基对结合的标准摩尔自由能。一般地，A-T对的ΔG0在8-15kJ/mol之间，C-G对的ΔG0在12-20kJ/mol之间，对于单碱基突变的错靶由此计算得到ΔE1/2的范围为0.3V＜ΔE1/2＜0.9V完全匹配的标靶从原理上讲不会有解链半高电位的移动。实验表明，确定ΔE1/2的误差一般小于±0.1V。考虑到标靶和错靶测量的各自可能的最大误差，因此给出前面的判断标准。本专利技术在实施方案中采用的嵌入式荧光染料为PicoGreen。它的最佳激发波长为488nm，由于实验条件所限，本专利技术在实施方案中采用514nm激光激发，其结果可能是荧光信号的强度和信噪比劣于最佳波长下的结果，但是不会有本质的区别。本专利技术利用电位扫描中的解链半高电位之差获得探针对于标靶和错靶的确定无疑的识别。由于DNA是带电分子，探针与标靶或者探针与错靶在芯片表面的结合能力受芯片基底电位的影响。存在着一定的表面电位范围，使得探针在与标靶有结合的时候却不能与错靶结合，反映在荧光信号中，标靶和错靶的荧光信号随电位的变化有明显不同的曲线关系。图1显示完全匹配的标靶和单点错配的错靶与发卡形DNA探针杂交时，荧光信号随电位扫描的变化。由图看出，标靶和错靶的荧光随电位变化曲线完全不同。图1中，ΔE1/2＝0.82V，标靶和错靶被确定无疑地识别开。图1还显示在没有外加电位(电位接近零)时，标靶和错靶与发卡形探针形成双螺旋的荧光信号接近。如果仅仅采用发卡形结构的探针，而没有适当的电位控制和扫描，无法确定无疑地获得SNP识别。图2显示上述标靶和错靶与线性DNA探针杂交时，荧光信号随电位扫描的变化。由图看出，SNP不同的标靶和错靶的荧光随电位变化曲线相近，无法确切区分哪一个是标靶，哪一个是错靶。说明仅仅是线性探针的电位扫描同样不能提供SNP识别的准确本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新生，魏芳，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：