【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于材料制备，涉及磁性纳米亲和吸附材料的制备、表征及其在靶蛋白的专一性识别、捕获、分离富集和纯化等方面的应用，具体涉及脱碱基核酸内切酶1的磁性纳米印迹材料及其制备方法和应用。
技术介绍
1、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1/氧化还原效应因子-1(简称脱碱基核酸内切酶，ape1)是一种多功能酶，对于维持细胞内稳态至关重要[1-3]。作为一种依赖于氧化还原的调节因子，ape1能够调控多个转录因子，包括nf-kb、ap-1、hif-1a和stat3等，在调节细胞信号传导、细胞衰老和炎症途径等方面发挥至关重要的作用[2-6]。在细胞核内，ape1是碱基切除修复途径中的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，同时，该修复功能还调控tnfα等细胞因子基因的转录。ape1的多功能使其成为癌症和神经系统疾病等多种疾病的发病机制中一个关键的调节因子[7]。
2、ape1共包含318个氨基酸，理论分子量为36kda。目前认为其复杂的亚细胞定位和多种功能的发挥是通过位于n端的信号序列的剪切及多种翻译后修饰调控的[8-12]。通过免疫磁珠对细胞裂解液及组织裂解液中ape1蛋白的分离富集，目前已经鉴定到了ape1多个氨基酸残基上的乙酰化修饰和泛素化修饰，但研究结果也提出了更具挑战性的问题。例如，在ape1的序列中位于34-127aa这部分氧化还原功能区里，目前已鉴定到了k52、k58、k79、k85、k98、k103、k125等多个泛素化位点，但仅鉴定到了k85和k125两个乙酰化位点。其他几个位点是否也发生乙酰化但功能完成后很快去乙酰化以致未被检测到
3、目前已有的免疫磁珠一般设计用于与目标细胞的表面相互作用或与细胞裂解后释放出的蛋白进行结合[5,6,8]。尚未有报道抗体修饰材料能有效进入活细胞并在复杂的细胞内环境中正常发挥作用，这与抗体需暴露在磁珠表面才能发挥作用，但在活细胞内易被破坏降解有密切关系。我们在早期的研究中发现了ape1与亲和素(avd)之间存在强烈的结合作用[13]。通过将ape1固定在亲和素修饰的磁核表面，然后利用多巴胺粘附性强和室温下易发生自聚反应的性质在温和条件下对ape1进行分子印迹，获得的磁性分子印迹纳米颗粒对ape1具有高亲和力和特异性识别能力，可从复杂生物样品(如血清、细胞裂解液等)中分离并富集ape1[14-15]。但是这些材料在用于活细胞内ape1的原位捕获和纯化富集时，受到细胞内环境更严重的干扰，在吸附容量、抗干扰能力和纯化效果等方面都还不能满足开展后续翻译后修饰研究和实际应用的需求。
4、针对上述问题，迫切需要开发一种抗干扰能力强、吸附容量大、能进入活细胞对ape1进行原位捕获并获得高纯度目标蛋白的新型高效吸附分离材料，为全面、系统地揭示ape1在细胞内结构变化的规律及其与各种功能间的调控关系提供强有力的研究手段。
5、参考文献：
6、1)evans ar,limp-foster m,kelley mr.going ape over ref-1.mutationresearch/dna repair.2000,461:83-108.
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8、3)oliveira tt,coutinho lg,de oliveira loa,timoteo ards,farias gc,agnez-lima lf.ape1/ref-1 role in inflammation and immune response.frontiersin immunology.2022,13:793096.
9、4)weaver tm,hoitsma nm,spencer jj,et al.structural basis for ape1processing dna damage in the nucleosome.nature communications.2022,13:5390.
10、5)nassour h,wang z,saad a,et al.peroxiredoxin 1interacts with andblocks the redox factor ape1 from activating interleukin-8expression.scientific reports.2016,6:29389.
11、6)wu hh,cheng yw,chang jt,wu tc,liu ws,chen cy,lee h.subcellularlocalization of apurinic endonuclease 1promotes lung tumor aggressiveness vianf-kappa b activation.oncogene.2010,29:4330-4340.
12、7)maynard s,hejl a.m,dinh t.s.t,keijzers g,hansen a.m,desler c,etal.,defective mitochondrial respiration,altered dntp pools and reduced apendonuclease 1activity in peripheral blood mononuclear cells of alzheimer'sdisease patients.aging 2015,7:793-815.
13、8)lópez dj,rodríguez ja, s.molecular mechanisms regulatingthe dnarepair protein ape1:a focus on its flexible n-terminal taildomain.international journal of molecular sciences.2021,22:6308.
14、9)chattopadhyay r,das s,maiti ak,et al.regulatory role of human ap-endonuclease(ape1/ref-1)in yb-1-mediated activation of the multidrugresistance gene mdr1.molecular and cellular biology.2008,28(23):7066-70本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，由内向外依次包括磁核、二氧化硅层、亲和素层、聚多巴胺层和PEG双封闭层，其特征在于，所述亲和素层由结合生物素达到饱和并经苯硼酸衍生物修饰的亲和素组成，所述聚多巴胺层中具有脱碱基核酸内切酶的印迹，所述PEG双封闭层由两种不同分子量的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇组成。
2.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，所述磁核为直径3-15nm的磁性纳米颗粒，包覆在磁核上的所述二氧化硅层的厚度为1-2nm，所述亲和素层的厚度小于或等于5nm，所述聚多巴胺层的厚度为3-5nm，所述PEG双封闭层的厚度为20-30nm。
3.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，所述磁核为Fe3O4磁性纳米颗粒或γ-Fe2O3磁性纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，在所述亲和素层中，亲和素的四个亚基上的生物素结合口袋都填充了生物素分子，并且蛋白表面没有多余的生物素分子；亲和素的糖基上修饰了苯硼酸衍生物，所述苯硼酸衍生物是3-羟基苯硼酸和/或3-
5.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，所述PEG双封闭层由一种分子量为15～30k的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇和一种分子量为1.5～3k的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇组成。
6.权利要求1～5任一所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料的制备方法，包括：先在包覆磁核的二氧化硅层表面共价连接上亲和素，然后加入生物素使亲和素的四个亚基完全转化为生物素结合态；移去多余的生物素分子后，加入模板分子APE1进行结合和固定；之后加入苯硼酸衍生物对亲和素表面的糖基进行修饰并与APE1表面的氨基酸进行预组装；然后在外层进行多巴胺聚合反应，再在聚多巴胺的表面分步进行两种分子量的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇修饰；最后洗脱模板分子APE1，得到所述脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，羧基化二氧化硅层包覆的磁核超声分散在纯水中的终浓度为0.1-0.5mg/mL，并加入终浓度为1-4mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺或N,N’-二环己基碳二亚胺或N,N‘-二异丙基碳二亚胺，以及终浓度为2-8mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺以活化羧基；步骤2)在溶液A中加入亲和素使之浓度为40-200nM，相应磁性纳米颗粒的浓度为0.1-0.5mg/mL；步骤3)在溶液B加入生物素使之浓度为200～400nM，相应磁性纳米颗粒的浓度为0.1～0.2mg/mL；步骤4)在溶液C中加入APE1的浓度为40-80nM，室温下孵育后加入苯硼酸衍生物的浓度为600～800nM；步骤5)在溶液D中加入多巴胺的浓度为0.08-0.12mg/mL；步骤6)在溶液E中加入的两种氨基修饰的甲氧基聚乙二醇的浓度均为5～10mg/mL。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)加入亲和素后在室温下震荡反应8-16个小时，然后用去离子水洗涤除去体系中的未反应物；步骤3)加入生物素在室温下进行结合反应；步骤4)加入APE1后室温下孵育20-40分钟，再加入苯硼酸衍生物室温下孵育30-60分钟；步骤5)加入多巴胺在室温下聚合反应80～100min；步骤6)两步氨基修饰的甲氧基聚乙二醇修饰都是在37℃下进行，时间均为8～12h；步骤7)先将磁性纳米颗粒在洗脱缓冲液中超声分散洗涤多次，再用乙醇超声分散洗涤多次。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述Tris溶液的浓度为10-15mM，pH为8.0-8.5；所述洗脱缓冲液含有100mM Bis-propane-Cl,100mM MgCl2,10mM DTT,0.1％Triton X-100。
11.权利要求1～5任一所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米分离材料在对生物样品中目标蛋白分子APE1进行识别、捕获、分离纯化和/或富集中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用是从细胞裂解液中分离纯化APE1，包括：在细胞裂解液中加入所述脱碱基核酸内切酶磁性纳米分离材料进行室温吸附，然后磁分离，收集磁性纳米颗粒，洗涤除去杂质，最后用洗脱缓冲液将APE1洗脱下来。
13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用是在活细胞内原位捕获APE1并进行分离纯化，包括：将所述脱碱基核酸内切酶磁性纳米分离材料磁转染入活细胞中，培养一段时间，然后破碎细胞，磁分离收集磁性纳米颗粒，洗涤...
【技术特征摘要】
1.一种脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，由内向外依次包括磁核、二氧化硅层、亲和素层、聚多巴胺层和peg双封闭层，其特征在于，所述亲和素层由结合生物素达到饱和并经苯硼酸衍生物修饰的亲和素组成，所述聚多巴胺层中具有脱碱基核酸内切酶的印迹，所述peg双封闭层由两种不同分子量的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇组成。
2.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，所述磁核为直径3-15nm的磁性纳米颗粒，包覆在磁核上的所述二氧化硅层的厚度为1-2nm，所述亲和素层的厚度小于或等于5nm，所述聚多巴胺层的厚度为3-5nm，所述peg双封闭层的厚度为20-30nm。
3.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，所述磁核为fe3o4磁性纳米颗粒或γ-fe2o3磁性纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，在所述亲和素层中，亲和素的四个亚基上的生物素结合口袋都填充了生物素分子，并且蛋白表面没有多余的生物素分子；亲和素的糖基上修饰了苯硼酸衍生物，所述苯硼酸衍生物是3-羟基苯硼酸和/或3-氨基苯硼酸。
5.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料，其特征在于，所述peg双封闭层由一种分子量为15～30k的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇和一种分子量为1.5～3k的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇组成。
6.权利要求1～5任一所述的脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料的制备方法，包括：先在包覆磁核的二氧化硅层表面共价连接上亲和素，然后加入生物素使亲和素的四个亚基完全转化为生物素结合态；移去多余的生物素分子后，加入模板分子ape1进行结合和固定；之后加入苯硼酸衍生物对亲和素表面的糖基进行修饰并与ape1表面的氨基酸进行预组装；然后在外层进行多巴胺聚合反应，再在聚多巴胺的表面分步进行两种分子量的氨基修饰的甲氧基聚乙二醇修饰；最后洗脱模板分子ape1，得到所述脱碱基核酸内切酶磁性纳米印迹材料。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，羧基化二氧化硅层包覆的磁核超声分散在纯水中的终浓度为0.1-0.5mg/ml，并加入终浓度为1-4mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺...
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