去细胞角膜及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种制备去细胞角膜的方法，其包含对动物角膜施以去细胞处理步骤，且所述方法的特征在于不使用蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。通过该方法使免疫原减少至一定程度并保留该天然角膜的结构和构型，使制备而成的角膜能够作为三维支架，于移植后支撑宿主细胞于其上生长。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去细胞角膜及其制备方法和用途本申请主张2016年1月8日提申的美国临时案第62/276,238号的所有权利，其内容整体并入本申请案中。
本
技术实现思路
属于制备去细胞角膜方法的领域，具体涉及所述去细胞角膜适合作为移植物使用，以及以所述去细胞角膜来治疗患有与角膜受损相关眼部疾病的个体的方法。
技术介绍
有多种疾病或病症影响角膜的功能，情况严重时甚至需要通过手术和角膜组织移植来进行修复。因猪角膜折射率及尺寸与人类角膜相当，猪角膜已经被公认是最适合作为人类角膜的替代品。然而，异种移植猪角膜往往会引发宿主严重的免疫反应(或移植排斥)，这是由于猪角膜去细胞处理过程中去除细胞不完全或所用的制剂残留(例如，化学物质和酶)所造成。因此，本领域需要一种经改良的角膜制备方法，其能保留天然角膜的结构和构型，并减少免疫原(即，任一种残留的细胞物质)，使制备而成的角膜能够作为三维支架，于移植后支撑宿主细胞于其上生长，且不会引起严重的免疫反应和诱发新生血管。
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旨在提供本
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的简化描述，以使公众对本
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具备基本的理解。此
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并非本
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的完整概述，且其用意并非在指出本专利技术实施例的重要/关键元件或界定本专利技术的范围。本
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之一第一方面是有关于一种制备去细胞角膜的方法。所述方法包含对动物角膜施以超临界流体(SCF)处理；其中，该方法的特征在于不包括使用蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。依据某些实施方式，所述方法更包含在SCF处理前，以水或含0.5-4.0MNaCl溶液处理角膜至少24小时。依据某些实施方式，在对角膜进行SCF处理时，更包含使用一辅溶剂并于压力73–500巴(Bar)以及温度30-50℃下，处理20-120分钟。所述SCF是超临界二氧化碳(supercriticalcarbondioxide,ScCO2)、超临界一氧化二氮(supercriticalnitrousoxide,ScN2O)、超临界烷类(supercriticalalkane)、超临界烯类(supercriticalalkene)、超临界醇类(supercriticalalcohol)、超临界丙酮(supercriticalacetone)或其组合。在一实施例中，所述SCF是ScCO2。在另一实施例中，所述SCF是ScN2O。所述辅溶剂可以是C1-4醇，且选自于以下成员所组成的群组中：乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、异丙醇(isopropanol)、丁醇(butanol)、异丁醇(isobutanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(t-butanol)和环丁醇(cyclobutanol)。在较佳的实施方式中，所述辅溶剂是30-100％(vol％)乙醇；在更佳的实施方式中，所述辅溶剂是50-98％乙醇；以及，在最佳的实施方式中，所述辅溶剂是60-75％(vol％)乙醇。依据一较佳实施方式，所述SCF处理的执行条件为连同60％(vol％)乙醇于压力350巴和45℃下，处理80分钟。在最佳实施方式中，本方法不含以蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。依据某些实施方式，所述角膜是取自于动物，其选自于以下成员所组成的群组中：猪、牛、绵羊、山羊、兔子、猴子或人类。在较佳的实施方式中，所述角膜是取自于猪。因此，本
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第二方面是提供利用以所述方法制备而成的去细胞角膜。依据较佳的实施方式，所述去细胞角膜是取自于猪角膜。再者，本
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第三方面是关于以本
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所制备的去细胞角膜，来治疗患有与角膜受损相关眼部疾病的个体的方法。所述方法包含将本专利技术所述去细胞角膜植入个体眼中以修复所述与角膜损伤相关眼部疾病的步骤。在可任选的实施方式中，所述方法包含在移植前，先在去细胞角膜上培养细胞。适合培养于本专利技术去细胞角膜上的细胞可选自于以下成员所组成的群组中：角膜内皮细胞、角膜基质细胞、角膜上皮细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。依据本
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某些实施方式，所述细胞是自体细胞。依据本
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其他实施方式，所述细胞是同种异体细胞。依据本
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某些实施方式，本方法所能治疗的眼部疾病是选自于以下成员所组成的群组中：角膜上皮营养不良(Fuchs'dystrophy)、圆锥角膜(keratoconus)、格状角膜营养不良(latticecorneadystrophy)、地图-点-指纹状营养不良(map-dot-fingerprintdystrophy)、虹膜角膜内皮综合征(iridocornealendothelialsyndrome)、虹膜痣综合征(柯根-立斯)(irisnevus(Cogan-Reese)syndrome)、钱得勒综合征(Chandler'ssyndrome)和自发性虹膜萎缩(essentialirisatrophy)。依据本
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其他实施方式，所述眼部疾病是由单纯泡疹病毒感染所致。依据本
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另一实施方式，所述眼部疾病是由沙眼披衣菌感染所致。依据本
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又一实施方式，所述眼部疾病是由化学性灼伤所导致的。在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本专利技术的基本精神及其他专利技术目的，以及本专利技术所采用的技术手段与实施方式。应当理解的是，前述一般性描述及以下详细描述是通过参考实施例来进行，并且旨在对如权利要求所保护的本专利技术做进一步解释。附图说明以下所附图式构成本说明书的一部分，其绘示出本专利技术多种实施方式的各种例示性系统、方法以及其他实施方式。本案详细说明的内容可依下列详细的描述结合图式说明，更清楚地理解其内容，其中，图1是依据本
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一实施方式所示SDSPAGE分析从(A)正常角膜组织，和(B)经ScCO2处理的角膜组织萃取的可溶性角膜总蛋白的结果；图2A是依据本
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一实施方式所示蛋白印迹分析正常角膜组织和经ScCO2处理的角膜组织中第一型胶原蛋白的结果；图2B是依据本
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一实施方式所示蛋白印迹分析正常角膜组织和经ScCO2处理的角膜组织中第二型胶原蛋白的结果；图3是实施例1.2去细胞角膜于放大倍率40X(A)和100X(B)下拍摄的组织染色的照片；以及图4是依据本
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一实施方式所示实施例1.2去细胞角膜分别于接种hADCs前(A)和后(B)在放大倍率2,000X下所拍摄的SEM照片。具体实施方式在此所提供的详细叙述和所附的图式为本
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的说明性的描述，但这并非实施或运用本专利技术具体实施例的唯一形式。在此所示的单数名词“一(a,an)”包含复数型，除非另有定义。虽然用以界定本专利技术较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考量而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备去细胞角膜的方法，包含以超临界流体处理动物的角膜，其特征在于，所述方法不包含以蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合来处理所述角膜的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.08 US 62/276,2381.一种制备去细胞角膜的方法，包含以超临界流体处理动物的角膜，其特征在于，所述方法不包含以蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合来处理所述角膜的步骤。2.如权利要求1所述的方法，还包含在施以所述超临界流体处理前，以水或含0.5-4.0MNaCl溶液处理所述角膜至少24小时。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述角膜施以所述超临界流体处理时，是在辅溶剂存在下，于压力73–500巴以及温度30-50℃下，处理20-120分钟。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超临界流体是超临界二氧化碳、超临界一氧化二氮、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类、超临界丙酮任一种或其组合。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超临界流体是超临界二氧化碳。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超临界流体是超临界一氧化二氮。7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述辅溶剂是体积百分比为30-100％的乙醇。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述角膜是以所述超临界流体连同体积百分比60％的乙醇，于压力350巴和45℃下处理80分钟。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物是选自于以下成员所组成的群组：猪、牛、绵羊、山羊、兔子、猴子和人类。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈星杰，曾繁伟，顾凯琪，谢达仁，
申请(专利权)人：亚果生医股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71