用于治疗缺血性疾病或损伤的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质及其可注射制剂制造技术

公开了使用工程化的心脏成纤维细胞衍生的三维细胞外基质(ECM)的组合物和方法。ECM包括结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，并且存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60％‑90％是纤连蛋白。可用于治疗心脏病或缺血性疾病或损伤的组合物是可注射的组合物，其中ECM被切成小碎片或冻干成粉末。所公开的方法包括通过使由ECM制成的无细胞贴片与受伤组织接触而不伴随递送治疗细胞来治疗缺血性疾病或损伤的方法，以及通过使贴片本身或与治疗细胞种植的贴片接触受伤肢体组织来治疗缺血性肢体损伤的方法。

Extracellular matrix and injectable preparations derived from cardiac fibroblasts for ischemic disease or injury

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗缺血性疾病或损伤的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质及其可注射制剂相关申请的交叉引用本申请要求2015年6月3日提交的美国临时申请序列号62/170,324的优先权，其全部内容通过引用并入本文。关于联邦资助的声明研究或开发本专利技术是在国立卫生研究院授予的DK080345和HHSN2682010000下由政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
缺血是动脉血液流向组织，器官或四肢的中断。缺血导致细胞代谢所需的氧气和葡萄糖短缺，从而导致组织损伤或死亡(缺血性损伤)。当心肌(心脏肌肉)血流量不足时，心肌缺血可导致心肌梗塞。心脏缺血性损伤是全球住院和死亡的主要原因，需要新的更有效的心脏缺血性损伤治疗来改善患者的结果。具有不同于心脏缺血的病因学和标准治疗方案的肢体缺血是流向肢体的血液缺乏的结果。在美国，每年大约有两百万人患有肢体缺血。发生后，这些患者中有60％没有可用的良好治疗选择。缺血性溃疡是缺血性肢体损伤的常见形式，是易于反复感染的长期的、非痊愈性的疼痛创伤。通常，没有药物可以成功治疗缺血性肢体损伤。组织的血运重建和/或各种皮肤替代物的使用是常见的治疗方法，但是这些治疗并不总是足以挽救受伤的肢体，导致截肢作为唯一可行的治疗选择。在先专利(美国专利号8,802,144，其通过引用全文并用于所有目的)和出版物(Schmuck，EG等人，CardiovascEngTechnol5(1)(2014):119-131，在此引入作为参考)Schmuck等人描述了由工程心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质制成的生物支架，其可以用作将治疗细胞转移至受损或患病的心脏组织的平台。用治疗细胞接种生物支架作为将治疗细胞递送至损伤或患病的心脏组织的机制。这种治疗方法需要进行侵入性和具有潜在的高风险手术，以将细胞接种的贴片放置在受损心脏的表面上。而且，这种治疗方法需要使用对患者来说是非内源性的治疗细胞，这进一步增加了复杂性、潜在风险和额外的调控障碍。最后，这种治疗方法特定供于心脏组织的损伤和疾病，不会被期望用于非心脏组织(例如肢体缺血性损伤)中发生的伤害。由于这些原因，使用先前公开的由工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质制成的生物支架的新组合物和方法是非常需要的。
技术实现思路
专利技术人在本文中证明，由美国专利8,802,144描述的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质制成的可注射组合物可以被制造并递送到心脏中。此外，本专利技术人在此证实，工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(无论是否接种治疗细胞)可以有效地治疗缺血性肢体损伤。最后，专利技术人在此证明，即使在不存在治疗性细胞的情况下，工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质也可以有效地治疗缺血性心脏和缺血性肢体损伤。因此，在第一方面，本公开内容包括用于治疗心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤的可注射组合物。该组合物包括工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的一个或多个片段，其包含结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中工程化细胞外基质中存在的结构蛋白的60％至90％是纤连蛋白。一个或多个片段足够小以通过18号皮下注射针的注射开口。另外，该制剂包含可注射的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，工程化的心脏细胞外基质的结构蛋白不是化学交联的。在一些实施例中，一个或多个片段具有20-500μm的厚度。在一些实施方案中，所述一个或多个片段是冻干粉末的形式。在一些实施方式中，工程化的心脏细胞外基质还包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，结缔组织生长因子(CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方式中，制剂基本上没有完整的心脏成纤维细胞。在一些这样的实施方案中，制剂完全不含细胞。在一些实施方式中，组合物还包含对心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤具有治疗作用的一种或多种细胞。在一些此类实施方式中，一种或多种细胞可包括骨骼肌成肌细胞，胚胎干(ES)细胞或其衍生物，诱导性多能干(iPS)细胞或其衍生物，多潜能成人生殖干细胞(maGCS)，骨髓间充质干细胞(BMSC)，极小胚胎样干细胞(VSEL细胞)，内皮祖细胞(EPC)，心脏生成细胞(CPC)，心脏球衍生细胞(CDC)，多潜能Isl1+心血管祖细胞(MICP)，心外膜衍生的祖细胞(EPDC)，脂肪衍生的干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质基质细胞，以及它们的组合。在一些实施方式中，组合物还包含一种或多种外源非细胞治疗剂。在一些这样的实施方式中，一种或多种外源性非细胞治疗剂可以包括一种或多种生长因子。在一些此类实施方式中，所述一种或多种生长因子可包括基质细胞衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些实施方式中，一个或多个片段足够小以通过27号皮下注射针的注射开口。第二方面，本公开内容包括用于治疗患有心脏疾病，心脏损伤或缺血性疾病或损伤的对象的方法。该方法包括向对象注射有效量的如上所述的制剂，由此降低心脏病，心脏损伤或缺血性疾病或损伤的严重程度。在一些实施方式中，所述心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或损伤由急性心肌梗塞，心力衰竭，病毒感染，细菌感染，先天性缺陷，中风，糖尿病足溃疡，外周动脉疾病(PAD)，PAD相关的溃疡或肢体缺血引起。第三方面，本公开内容包括用于制备可注射组合物的方法。该方法包括以下步骤：(a)获得具有20-500μm厚度且包含结构蛋白纤连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白的脱细胞工程化的心脏成纤维细胞衍生细胞外基质，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白的60％至90％是纤连蛋白；(b)(i)将工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质切成足够小以便能够穿过18号皮下注射针的注射口的片段，或(ii)将工程化的成纤维细胞源细胞外细胞外基质冻干成粉末；和(c)将切块或冻干的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质与可注射的药学上可接受的载体混合。在一些实施方式中，该方法还包括使得到的组合物通过具有小于0.60mm2的最小流动面积的一个或多个通道的步骤。“最小流动面积”指的是通道的最小横截面积，如在垂直于通过通道的流动方向的横截面上测量的。例如，如果通道是标准皮下针，则最小通流面积将是限定皮下针内表面横截面的圆的面积。具有0.838mm内径的标准18号的皮下针具有基于圆形公式的面积(横截面面积＝πr2)的最小流动面积0.552mm2。在一些这样的实施例中，一个或多个通道中的至少一个具有小于0.040mm2的最小流通面积。在一些实施方式中，获得工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的步骤通过下述进行：(a)从心脏组织分离心脏成纤维细胞或从诱导性多能干(iPS)细胞衍生心脏成纤维细胞；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗心脏疾病、心脏损伤或缺血性损伤的可注射组合物，其包含：(a)工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的一个或多个片段，其包含结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中该工程化的细胞外基质中存在的结构蛋白质的60％‑90％是纤连蛋白，其中所述一个或多个片段足够小以通过18号皮下注射针的注射开口；和(b)可注射的药学上可接受的载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.03 US 62/170,3241.一种用于治疗心脏疾病、心脏损伤或缺血性损伤的可注射组合物，其包含：(a)工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的一个或多个片段，其包含结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中该工程化的细胞外基质中存在的结构蛋白质的60％-90％是纤连蛋白，其中所述一个或多个片段足够小以通过18号皮下注射针的注射开口；和(b)可注射的药学上可接受的载体。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述工程化的心脏细胞外基质的结构蛋白不是化学交联的。3.如权利要求1所述的组合物，其中所述一个或多个片段具有20-500μm的厚度。4.权利要求1的组合物，其中所述一个或多个片段为冻干粉末的形式。5.如权利要求1所述的组合物，其中所述工程化的心脏细胞外基质还包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，结缔组织生长因子(CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物基本上没有完整的心脏成纤维细胞。7.如权利要求6所述的组合物，其中所述组合物不含细胞。8.如权利要求1所述的组合物，还包含对心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤具有治疗作用的一种或多种细胞。9.如权利要求8的组合物，其中所述对心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤有治疗作用的一种或多种细胞选自骨骼肌成肌细胞，胚胎干(ES)细胞或其衍生物，诱导性多能干(iPS)细胞或其衍生物，多潜能成人生殖干细胞(maGCS)，骨髓间充质干细胞(BMSC)，极小胚胎样干细胞(VSEL细胞)，内皮祖细胞(EPC)，心脏生成细胞(CPC)，心脏球衍生细胞(CDC)，多潜能Isl1+心血管祖细胞(MICP)，心外膜衍生的祖细胞(EPDC)，脂肪衍生的干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质基质细胞，以及它们的组合。10.如权利要求1所述的组合物，还包含一种或多种外源性非细胞治疗剂。11.如权利要求10所述的组合物，其中所述一种或多种外源性非细胞治疗剂包括一种或多种生长因子。12.如权利要求11所述的组合物，其中所述一种或多种生长因子选自表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)、基质衍生因子-1(SDF-1)和角质形成细胞生长因子(KGF)。13.如权利要求1所述的组合物，其中所述一个或多个片段足够小以穿过27号皮下注射针的注射开口。14.一种治疗患有心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或缺血性损伤的对象的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1所述的组合物注射入所述对象，由此减少心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或局部缺血伤害的严重程度。15.如权利要求14所述的方法，其中所述心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或缺血性损伤由急性心肌梗塞，心力衰竭，病毒感染，细菌感染，先天性缺陷，中风，糖尿病足溃疡，外周动脉疾病(PAD)，PAD相关的溃疡或肢体缺血造成。16.一种治疗具有缺血性疾病或损伤的对象的方法，包括使呈现局部缺血损伤的对象的组织与具有20-500μm厚度的无细胞工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质接触，所述细胞外基质包含结构蛋白纤连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·施穆克，A·拉瓦尔，
申请(专利权)人：威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US