一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒，该试剂盒由A液和B液组成，A液是乙醇和Triton的混合溶液，B液是己基‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷水溶液。A液和B液的组合应用，能够最大限度的保证组织脱细胞过程中维持组织营养微环境和三维超微形态结构，无毒且具有抑制细菌生长的作用。应用本发明专利技术的试剂盒制备得到结构完整、无毒、无免疫原性的去细胞生物支架，用于组织再生工程。

A cell depot for maintaining tissue ultrastructure and nutritional microenvironment

Cell kit and the invention relates to a method for maintaining tissue ultrastructure and nutritional micro environment, the kit by A solution and B solution, A solution is a mixed solution of ethanol and Triton, B solution is hexyl beta D glucopyranoside aqueous solution. The combination of A solution and B solution can maximize the organization of nutritional microenvironment and three-dimensional ultrastructure in the process of tissue decellularizing. It is non-toxic and has the effect of inhibiting bacterial growth. The present invention is used to prepare a complete, nontoxic and immunogenic acellular biological scaffold for tissue regeneration.

【技术实现步骤摘要】
一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒
本专利技术涉及组织工程材料领域，具体而言，本专利技术涉及一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒。
技术介绍
机体内各种器官及组织可以视为由两部分构成：细胞和细胞外成分，也称为细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)。大部分免疫原性的物质存在于细胞内。相比单一或复合的人工合成生物分子材料，脱去细胞后的细胞外基质不仅有更接近天然的生物体内的细胞外环境，而且最大程度保留了其生物活性，在组织工程中得到越来越多的重视和应用。细胞外基质制备是通过脱除组织细胞的方法去除存在于细胞内的免疫原性成分，以得到可以用作相应组织的替代物和支架材料的细胞外基质。体内诸多组织器官的构成和特性不尽相同，针对这些组织器官都有各自适合的脱细胞方案。目前脱细胞基质的制备方法有很多，主要包括物理法、化学法和生物处理法。物理法主要是通过物理的作用如冻融、液体高压、超声波和电击等脱除细胞，它们的基本原理是破坏组织中细胞的细胞膜结构，细胞膜结构的变化导致细胞产生不良生物化学反应，持续的处理将使细胞死亡，随后通过溶液的清洗、核酸及脂质的去除而脱去组织的细胞。化学法就是使用化学试剂破碎细胞达到去除细胞的目的。一些特定的化学试剂如酸、碱和去污剂等可以渗透组织的各层，溶解细胞膜的双分子层磷脂甚至破坏细胞膜蛋白导致细胞死亡和破碎，之后通过振荡清洗等步骤洗去细胞残渣和抗原物质。生物处理法主要是用酶试剂来裂解细胞。例如脱细胞方法中通常会用到胰蛋白酶，它是一类丝氨酸蛋白酶，能选择性地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，胰蛋白酶的作用使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。然而，上述脱细胞处理试剂和方法存在以下通病：(1)制备的生物支架不能维持三维空间形态，大量重要蛋白流失，原组织的微观结构和营养微环境被破坏。(2)所用试剂有毒性且不易去除，所制备的生物支架存在组织毒性和免疫刺激性的风险，需要繁琐的后期处理除去残留的去污剂。(3)所用试剂彼此之间应用独立，处理时间较长且效率低，不能协同发挥效果，缺乏一种简便的试剂盒。(4)不具备抑菌防腐作用，制备的生物支架需要进一步灭菌处理。目前尚未见到有效的技术方法，能够同时解决脱细胞基质制备过程中存在的上述通病。
技术实现思路
为了克服现有的脱细胞处理试剂和方法的不足，同时解决脱细胞基质制备过程中存在的通病，本专利技术提供一种维持组织超微结构和营养微环境的无毒性且应用简便的脱细胞试剂盒。因此，本专利技术的核心是提供一种更安全高效的脱细胞试剂盒。本专利技术人研究发现，在采用Triton破坏细胞膜的同时加入适当的乙醇溶液，可以在细胞膜破坏过程中实现组织结构的固定，能够最大程度地保护细胞骨架微观形态，维持完整的生物支架微观结构，并且具备抑菌作用。本专利技术人还发现，己基-β-D-吡喃葡萄糖苷水溶液(Hexylβ-D-glucopyranoside，HGP)作为去污剂具备生物相容性高、无毒、生物可降解等优点，协同Triton和乙醇溶液应用，可以更好地维持脱细胞处理前的细胞组织营养微环境和微观形态，且残留的溶液不会产生任何毒性，避免了繁琐的后期处理过程。此外，本专利技术人还发现，应用新型脱细胞试剂盒处理组织时，可以通过灌注、冲洗或浸润的一种操作或多种操作组合，制备得到来源于动物组织或植物组织的多种去细胞生物支架。因此，本专利技术的一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒是由A液和B液组成，上述A液为乙醇和Triton的混合溶液，其中乙醇的质量百分含量为85％～99.9％，Triton的质量百分含量为0.1％～15％；上述B液为己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的水溶液，其中己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量百分含量为1％～65％，应用上述的脱细胞试剂盒处理组织制备去细胞生物支架的步骤如下：(1)用相当于组织体积50～100倍量的A液处理组织；(2)用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经(1)处理的组织；(3)用相当于组织体积50～100倍量的B液处理经(2)处理的组织；(4)用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经(3)处理的组织，得到去细胞生物支架。上述的A液中乙醇的质量百分含量为90％～95％，Triton的质量百分含量为1％-10％，所述B液中己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量百分含量为10％～45％。上述的A液中乙醇的质量百分含量为92％，Triton的质量百分含量为8％，所述B液中己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量百分含量为35％。应用上述的脱细胞试剂盒处理组织的温度范围为10℃～42℃，A液的处理时间为1小时～24小时，B液的处理时间为12小时～72小时。应用上述的脱细胞试剂盒处理组织得到去细胞生物支架，温度范围为20℃～40℃，A液的处理时间为6小时～18小时，B液的处理时间为18小时～48小时。应用上述的脱细胞试剂盒处理组织得到去细胞生物支架，温度范围为37℃，A液的处理时间为12小时，B液的处理时间为36小时。上述的处理是指采用灌注、冲洗或浸润的一种操作或多种操作组合。上述的组织来源于动物或植物。应用上述的脱细胞试剂盒处理组织得到的去细胞生物支架，用于组织再生工程。本专利技术的一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒与现有的脱细胞试剂和方法相比，具有以下优点：①将能够协同起效的三种试剂组合，制成试剂盒，使脱细胞过程更便捷、安全和高效。②本专利技术的试剂盒具有良好的生物相容性和生物可降解性。③应用本专利技术的试剂盒制备生物支架，有效保留了原组织的营养微环境和微观三维形态结构。④本专利技术的试剂盒不含任何有毒组分，不会产生因试剂残留引起毒副反应或免疫原性；⑤本专利技术的试剂盒中乙醇和己基-β-D-吡喃葡萄糖苷均有杀菌和抑菌作用，且具有生物降解好、无毒、无免疫原性、对环境无污染等优点。⑥本专利技术的试剂盒保存、运输和应用更方便。因此相比现有技术，本专利技术的脱细胞试剂盒同时解决脱细胞基质制备过程中存在的通病问题，是一种更安全高效的脱细胞试剂盒。具体实施方式下文将详细描述本专利技术具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。实施例1制备脱细胞试剂盒按照表1的A液和B液的组分比例，制备实验组和对照组的脱细胞试剂盒。表1脱细胞试剂盒的组成注：“/”代表该组分为0。实施例2应用脱细胞试剂盒制备去细胞生物支架并进行质量评价本实施例应用实施例1的各组脱细胞试剂盒制备大鼠骨组织去细胞生物支架。【去细胞生物支架的制备】取若干只大鼠，分离出大鼠的骨组织。应用实施例1的脱细胞试剂盒按照如下步骤处理组织，制备大鼠骨组织的去细胞生物支架。①用相当于组织体积50-100倍量的A液处理组织；②用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经①处理的组织；③用相当于组织体积50-100倍量的B液处理经②处理的组织；④用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经③处理的组织，得到去细胞生物支架。以上处理细胞的过程，温度设置为25℃，A液和B液的处理时间均设置为48小时。【去细胞生物支架的质量评价】按照以下各项指标检测实施例1各组脱细胞试剂盒制备的去细胞生物支架的质量。(1)去细胞化程度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒，其特征在于：所述的脱细胞试剂盒是由A液和B液组成，所述A液为乙醇和Triton的混合溶液，其中乙醇的质量百分含量为85％～99.9％，Triton的质量百分含量为0.1％～15％；所述B液为己基‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷的水溶液，其中己基‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷的质量百分含量为1％～65％，应用所述的脱细胞试剂盒处理组织制备去细胞生物支架的步骤如下：(1)用相当于组织体积50～100倍量的A液处理组织；(2)用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经(1)处理的组织；(3)用相当于组织体积50～100倍量的B液处理经(2)处理的组织；(4)用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经(3)处理的组织，得到去细胞生物支架。

【技术特征摘要】
1.一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒，其特征在于：所述的脱细胞试剂盒是由A液和B液组成，所述A液为乙醇和Triton的混合溶液，其中乙醇的质量百分含量为85％～99.9％，Triton的质量百分含量为0.1％～15％；所述B液为己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的水溶液，其中己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量百分含量为1％～65％，应用所述的脱细胞试剂盒处理组织制备去细胞生物支架的步骤如下：(1)用相当于组织体积50～100倍量的A液处理组织；(2)用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经(1)处理的组织；(3)用相当于组织体积50～100倍量的B液处理经(2)处理的组织；(4)用相当于组织体积100倍量的0.01M磷酸盐缓冲液冲洗经(3)处理的组织，得到去细胞生物支架。2.根据权利要求1的一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒，其特征是：所述的A液中乙醇的质量百分含量为90％～95％，Triton的质量百分含量为1％-10％，所述B液中己基-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量百分含量为10％～45％。3.根据权利要求2的一种维持组织超微结构和营养微环境的脱细胞试剂盒，其特征是：所述的A液中乙醇的质量百分含量为92％，Triton的质量百分含量为8％...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵应征，陈翩翩，徐荷林，林倩，朱群燕，金冰慧，沈碧欣，诸葛德力，鲁翠涛，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33