髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法，该方法具体为，将猪SIS组织剥离后，经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞SIS材料，球磨粉碎为直径200um微粒，并与分离的髓核细胞共培养及再次脱细胞处理，获得的多重脱细胞可注射髓核修复材料。本发明专利技术在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常生理状况髓核细胞的生长环境。

Preparation of multiple decellular materials for porcine small intestinal submucosa modified by nucleus pulposus cells

The present invention discloses a kind of nucleus pulposus cells modified small intestinal submucosa acellular multiple material preparation method, and the concrete method, the pig SIS tissue after stripping, the protease inhibitors containing saline buffer, organic solvent solution containing Triton, X, PBS buffer containing SDS PBS buffer the PBS and DNA containing enzyme buffer, obtain acellular SIS material, grinding diameter of 200um particles, and the separation of the nucleus pulposus cells were cultured again and acellular treatment, obtained multiple acellular injectable nucleus repair materials. The invention has the immunogenicity in removal of allogeneic or xenogeneic cells at the same time, can retain the integrity of the original ECM, with good extracellular microenvironment, biochemical factors and biomechanical properties, can maximize the simulation environment for the growth of normal physiological conditions of nucleus pulposus cells.

【技术实现步骤摘要】
髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法
本专利技术属于腰椎间盘组织修复及其再生
，尤其涉及一种天然组织来源的及天然细胞修饰的多重脱细胞髓核修复材料及其制备方法。
技术介绍
腰背部疼痛在人群中的发生率高达60％，而其中的相当部分与腰椎间盘退变密切相关。虽然临床上可通过多种手术或非手术方法治疗腰椎间盘退变，但诸如疼痛控制、脊柱融合术等方法仅可缓解症状，而无法重建脊柱结构。为此，人工椎间盘修复材料是目前研究的方向所在，但由于生物相容性，髓核细胞再生困难等不足，目前仍然没有合适的材料能够真正用于椎间盘退变的治疗，使其恢复原有的生理功能。此外，由于对椎间盘进行手术操作本身亦可诱导其退变，因此修复材料因具有可微创注射的特征。而目前对于具备类似性能的髓核修复材料还基本无报道。细胞外基质(ECM)含有正常细胞在组织或器官内正常功能所需要的各种生化因子及微观三维结构，是十分适宜细胞生长的天然支架。研究报告认为，小肠黏膜下层(SIS)是相当优良的ECM结构，运用人工脱细胞技术处理去除抗原及异体细胞成分的猪SIS进行疝、表皮损伤等疾病修复有一定的研究报道。然而，目前还未有人报道采用脱细胞SIS修复椎间盘退变。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提出了一种髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料及制备方法。该方法在对SIS进行去细胞及微粒化处理后，进一步使用髓核细胞改造SIS的ECM构成使其更为适应椎间盘退变，并进行二次脱细胞处理，得到稳定的可注射多重脱细胞髓核修复材料。为解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：步骤(1)取猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；步骤(2)置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度，重复上述流程5次；步骤(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床120rpm震荡8-24小时；步骤(4)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂2-12小时；步骤(5)在含TritonX的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；步骤(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡0.5-24小时；步骤(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡1-36小时；步骤(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得天然组织来源的猪SIS材料；步骤(9)将SIS材料切割成小块，浸泡于无菌生理盐水中，使用组织匀浆机以6,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共5-20周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；步骤(10)先后将SIS悬浊液通过60目及80目细胞筛，滤除过大或过小微粒；步骤(11)将传代的髓核细胞及SIS颗粒共同置于立体培养基内进行共培养2-4周，即得髓核细胞修饰的SIS微粒材料；步骤(12)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；步骤(13)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得髓核修饰的天然组织来源的猪SIS多重脱细胞材料；混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的体积比例为1:1；步骤(5)-(7)及(12)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1、10:1；步骤(3)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时；步骤(11)、(12)完成后用生理盐水浸泡5小时；所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；所述的有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、浓度10％-100％的丙酮溶液或浓度30％-70％的乙醇溶液；所述的含TritonX的PBS缓冲液为浓度1％-10％的TritonX-200或TritonX-100的PBS缓冲液；所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％-10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01-0.5mg/ml；共培养指将髓核细胞与1000微球/mL的SIS微粒在立体培养环境下共同培养，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液针对目前用于修复椎间盘退变材料及其制备方法存在的问题，本专利技术人建立了一种以天然猪SIS为基础，髓核细胞修饰的多重脱细胞可注射髓核修复材料的制备方法。改法将猪SIS经过球磨，含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含TritonX的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，并用髓核细胞对该材料进行改造，再次经脱细胞流程获得脱细胞SIS材料。本专利技术在条件温和、无ECM损害、快速稳定地利用SIS优良的ECM性能同时，最大限度地通过髓核细胞对其特性进行改造，所得髓核修复材料具有生物相容性好，髓核细胞粘附生长能力强，实用性高(可注射)的优点，可用于临床椎间盘退变情况下的髓核修复。相对于现有技术，本专利技术的显著进步在于：(1)本专利技术在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常生理状况髓核细胞的生长环境。(2)本专利技术构建的材料具有良好的可注射性，以满足临床运用中高效、低损伤地进行髓核修复操作的要求。(3)本专利技术可以为病人订制具有个体化的髓核修复材料，通过使用患者自体髓核细胞对材料进行改造时可进一步增强材料的修复效果。附图说明图1是本专利技术SIS微粒的粒径大小分布测试图；图2是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的HE染色无细胞及无细胞核成分残留示意图；图3是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的Masson三色染色无细胞及无细胞核成分残留，且胶原含量丰富示意图；图4是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的DAPI染色无细胞及细胞核成分残留示意图；图5是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料DNA定量检测，在初次和再次脱细胞后均几乎不含有DNA成分图；图6是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的阿尔新蓝胶原定型检测，显示保留大量胶原成分图；图7是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料在扫描电镜下表现为完整的，适宜细胞生长的空间立体结构图；图8是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料经CCK-8检测无细胞毒性图；图9(a)是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料用于修复兔子椎间盘退变造模时的效果图(核磁共振，T2序列)。图9(b)是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料用于修复兔子椎间盘退变模型3月后的修复效果图(核磁共振，T2序列)具体实施方式实施例1髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究(1)猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；取材大小通常为5cmx5cm。(2)将SIS置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度；重复上述流程10次，以利于后续试剂扩散；(3)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(浓度为1％，蛋白酶抑制剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：步骤(1)取猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；步骤(2)置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度，重复上述流程5次；步骤(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床120rpm震荡8‑24小时；步骤(4)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂2‑12小时；步骤(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1‑36小时；步骤(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡0.5‑24小时；步骤(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡1‑36小时；步骤(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得天然组织来源的猪SIS材料；步骤(9)将SIS材料切割成小块，浸泡于无菌生理盐水中，使用组织匀浆机以6,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共5‑20周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；步骤(10)先后将SIS悬浊液通过60目及80目细胞筛，滤除过大或过小微粒；步骤(11)将传代的髓核细胞及SIS颗粒共同置于立体培养基内进行共培养2‑4周，即得髓核细胞修饰的SIS微粒材料；步骤(12)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1‑36小时；步骤(13)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得髓核修饰的天然组织来源的猪SIS多重脱细胞材料；混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的体积比例为1:1；步骤(5)‑(7)及(12)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1、10:1；步骤(3)‑(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时；步骤(11)、(12)完成后用生理盐水浸泡5小时；所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％‑5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；所述的有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、浓度10％‑100％的丙酮溶液或浓度30％‑70％的乙醇溶液；所述的含Triton X的PBS缓冲液为浓度1％‑10％的Triton X‑200或Triton X‑100的PBS缓冲液；所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％‑10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1‑20mmol/L的Tris；所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01‑0.5mg/ml；共培养指将髓核细胞与1000微球/mL的SIS微粒在立体培养环境下共同培养，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。...

【技术特征摘要】
1.髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：步骤(1)取猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；步骤(2)置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度，重复上述流程5次；步骤(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床120rpm震荡8-24小时；步骤(4)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂2-12小时；步骤(5)在含TritonX的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；步骤(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡0.5-24小时；步骤(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡1-36小时；步骤(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得天然组织来源的猪SIS材料；步骤(9)将SIS材料切割成小块，浸泡于无菌生理盐水中，使用组织匀浆机以6,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共5-20周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；步骤(10)先后将SIS悬浊液通过60目及80目细胞筛，滤除过大或过小微粒；步骤(11)将传代的髓核细胞及SIS颗粒共同置于立体培养基内进行共培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：单治，林贤丰，王晟毓，范顺武，赵凤东，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33