本发明专利技术公开了一种口腔根管微生物感染检测微阵列芯片的制备方法和使用方法。本发明专利技术的口腔根管微生物感染检测微阵列芯片，是根据１６ＳｒＲＮＡ基因组序列设计。芯片上所包含的每个特异检测探针解链温度相近，相同序列尽量减少；阳性探针选取所有检测微生物１６ＳｒＲＮＡ基因中保守的序列区，设计与特异探针相近的解链温度，不同的碱基序列的探针。在醛基修饰的载玻片表面点阵并固定。本发明专利技术的口腔根管微生物感染检测微阵列芯片可用于患者口腔根管微生物感染的检测。本发明专利技术的芯片只需一次ＰＣＲ扩增反应和杂交反应就可确定口腔根管微生物感染的种类具有比ＰＣＲ方法更高的灵敏度和特异性；与传统培养法相比，检测时间大大缩短，使临床检测成为可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种口腔根管微生物感染检测微阵列芯片及其制作方法及利用该口腔根管微生物感染检测微阵列芯片对于患者口腔根管微生物感染的检测方法。
技术介绍
现在已经知道牙髓根尖周病主要是以厌氧菌为主的混合感染。自70年代以来，由于厌氧培养技术的重大突破，越来越多的厌氧菌从感染牙髓和根管中分离出来，使人们重新认识到厌氧菌才是牙髓根尖周病的优势菌，厌氧菌在牙髓根尖周感染中的作用也越来越受重视。目前比较公认的感染根管优势菌主要有专性厌氧菌(卟啉菌Porphyromonas、普氏菌Prevotella、消化链球菌Peptostreptococcus、具核梭杆菌Fusobacteriumnucleatum、Veillonella parvula)，兼性厌氧菌(放线菌Actinomyces、乳杆菌Lactobacillus、粪肠球菌Enterococcus faecalis、变形链球菌Streptococcusmutans)，等。虽然培养方法越来越先进，但有学者估计，即使用最好的培养方法也仅能得到20％至70％的细菌，也就是说根管中的很多细菌还是被漏检了。因此光靠培养的方法，使人们对感染根管细菌的认识受到一定的局限性。另外，由于培养法还存在着费时、费力、灵敏度较低等缺点，其作为微生物检测的金标准地位已受到部分学者的质疑。而对于较常用的生化鉴定法，由于感染根管中的一些优势菌在分类学上非常接近，生化特性近于相似，用生化鉴定法很容易造成假阳性或假阴性。自80年代以来，分子生物学得到了空前的发展，许多研究表明在检测细菌方面分子生物学方法比培养法敏感度更高，尤其对于那些较难培养或目前根本培养不出的细菌。Choi等用PCR扩增16SrRNA基因的方法检查一个牙周炎患者的龈下菌斑，结果发现20种不能培养的螺旋体；Conrads等则用16SrDNA引导的PCR首次在根管内发现福赛类杆菌。因此将分子生物学方法用于根管细菌的检测，不仅会使我们目前的根管细菌学理论得到巩固，而且还可起到进一步发展和补充作用。目前报道较多的方法主要有PCR法、PCR加杂交法等，这些方法虽然大大提高了检测的灵敏度，简化了检测手续，但也存在一些不足之处。其中最局限的是上述方法在一次实验中只能检测一种或几种微生物，检测微生物的种类非常少。这对于一个感染根管细菌标本中就含有数十种细菌的实际情况来说，要达到一个较理想的检测还是相当难的。生物芯片是最近十年发展起来的应用于分子生物学研究的一项新技术，它是以核酸分子杂交技术为基本原理，并结合机械制造技术、计算机技术等其他诸多高新科技，被广泛运用于核酸序列测定、基因突变检测、基因表达情况分析等领域。近年来将生物芯片运用于微生物的检测和分类的报道也越来越多。设计合成特异性微生物探针，将其点样于芯片上，待测微生物样品经DNA抽提，PCR标记，即可与芯片进行杂交反应，经扫描测读，输出结果，经分析可判断出样品中微生物种类。相对于一般的分子生物学方法，用生物芯片检测微生物更具有大容量、灵敏、快速、准确、高效、简便等优点，具有广阔的应用前景。而生物芯片检测法的这些优点，正是符合感染根管细菌标本检测的理想方法。许多文献报道了相关的技术，如1.Choi BK，Paster BJ，Dewhirst FE，Gobel UB.Diversity of cultivableand uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructiveperiodontitis.Infect Immun 1994；621889-95. 2.Conrads G，Gharbia SE，Lampert F，Shah HN.The use of a 16S rDNAdirected PCR for the detection of endodontopathogenic bacteria.J Endodon1997；23433-8. 3.Jung II-Y，Choi B-K，Kum K-Y，et al.Molecular epidemiology andassociation of putative pathogens in root canal infection.J Endodon 2000；26599-604. 4.Siqueira Jr，Rocas IN，Oliveira JCM，et al.Detection of putative oralpathogens in acuteperiradicular abscesses by 16S rDNA-Directed polymerasechain reaction.J Endodon 2001；27164-7. 5.Call DR，Brockman FJ，Chandler DP.Detecting and genotypingEscherichia Coli O157H7 using multiplexed PCR and nucleic acidmicroarrays.Int J Microbiol 2001 Jul 20；67(1-2)71-80. 6.Cho JC，Tiedje JM.Bacterial species determination from DNA-DNAhybridization by using genome fragments and DNA microarrays.Appl EnvironMicrobiol 2001 Aug；67(8)3677-82. 因此，开发研究一种新的生物芯片，用于对口腔根管微生物感染的检测，是人们所十分期望的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是公开一种口腔根管微生物感染检测微阵列芯片，以克服现有技术存在的检测低通量、灵敏度不高和检测速度较慢的缺陷，以满足医疗领域的需要；本专利技术需要解决技术问题之二是提供所述口腔根管微生物感染检测微阵列芯片的制作方法；本专利技术再一个需要解决的技术问题是公开所述口腔根管微生物感染检测微阵列芯片的使用方法。本专利技术的技术构思是这样的本研究目的利用细菌16SrRNA基因保守区设计一对引物，可扩出所有细菌，再利用其可变区设计特异性探针可鉴定细菌的原理，通过已知口腔微生物的DNA序列，设计制作出特异性寡核苷酸探针，制成微阵列芯片，初步构建能达到定性检测十五种感染根管细菌(具核梭杆菌Fusobacteriumnucleatum、微小消化链球菌Peptostreptococcus micros、牙髓卟啉菌Porphyromonas endodontalis、牙龈卟啉菌Porphyromonas gingivalis、中间普氏菌Prevotella intermedia、变黑普氏菌Prevotella nigrescens、口普氏菌Prevotella oris，福赛类杆菌Bacteroides forsythus、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、变形链球菌Streptococcus mutans、血链球菌Streptococcus sanguis，内氏放线菌Actinomyces naeslundii、衣氏放线菌Acti本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种口腔根管微生物感染检测微阵列芯片，其特征在于，在经修饰的载玻片表面点阵并固定有下列１６条探针： ＊＊＊。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦苏，曹慧敏，赵建龙，唐子圣，赵淑娟，刘正，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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