【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过体外转录/翻译系统进行蛋白质合成的方法。更具体而言，本专利技术涉及通过体外转录/翻译系统高效合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法。
技术介绍
人们试图通过基因重组技术来生产可用作药物或试剂的蛋白质。优选地，考虑到操作的简便性和效率，人们已将诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，霉菌和酵母这样的微生物，诸如蚕这样昆虫，诸如牛这样哺乳动物，以及可栽培植物、昆虫和动物细胞，目前已用于基因重组技术中。通过基因重组技术生产蛋白质的方法已被广泛应用。不过，使用这种方法可能导致，譬如目的蛋白的表达水平低、表达无活性的蛋白及形成聚集物这些问题。因此，需要反复进行诸如检查培养条件、生长条件或诱导条件，或试验多种表达系统这样的试误(trial-and-error)过程。已报道许多蛋白甚至在考察这些条件后，也很难被合成。 与此同时，已知一种不使用这些生物或细胞的蛋白质合成方法，其也被称为“无细胞蛋白质合成”。这种无细胞蛋白质合成系统也描述为“体外转录/翻译系统”。通过该系统，用从大肠杆菌、兔网织红细胞、麦胚细胞或其它类似细胞中所制备的提取物或天然成分对模板基因进行转录/翻译，从而合成蛋白质。无细胞蛋白质合成系统的特征在于可克服使用生物或细胞所遇到的限制。这是因为用该系统可合成干扰生物和细胞功能的蛋白质，可通过96孔板或384孔板的形式合成多种蛋白质，并可同时对多种合成条件进行测试。 但已知即使使用这种无细胞蛋白质合成系统，仍有一个问题，即合成的蛋白质形成了凝聚物而不形成为相应的天然结构。其原因可能是具有分子间和/或分子内二硫键的蛋白质的二硫键不能正确交联。...
【技术保护点】
一种合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法，包括使用包含以下ａ），ｂ），和ｃ）和／或ｄ）的反应系统：ａ）至少一个编码目标蛋白的模板核酸；ｂ）包含多种具有特定存在量和纯度的组分的、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白 质的蛋白质合成反应基本试剂；ｃ）至少一种具有特定存在量和纯度的、可催化二硫键氧化还原的氧化还原酶；及ｄ）至少一种具有特定存在量和纯度的调节二硫键氧化还原状态的氧化还原试剂。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2004-4-30 136520/20041.一种合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法，包括使用包含以下a)，b)，和c)和/或d)的反应系统a)至少一个编码目标蛋白的模板核酸；b)包含多种具有特定存在量和纯度的组分的、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；c)至少一种具有特定存在量和纯度的、可催化二硫键氧化还原的氧化还原酶；及d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节二硫键氧化还原状态的氧化还原试剂。2.权利要求1所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质合成基本反应试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。3.权利要求1所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。4.权利要求1-3中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中氧化还原酶是催化促进和/或异构化蛋白质的二硫键的酶。5.权利要求1-4中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中氧化还原酶包括蛋白质二硫键异构酶类(PDIs)或二硫键交换蛋白。6.权利要求5所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质二硫键异构酶的浓度为0到10μM。7.权利要求5或6所述的合成蛋白质的方法，其中二硫键交换蛋白的浓度为0到10μM。8.权利要求1-7中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中氧化还原试剂为二硫苏糖醇或氧化型谷胱甘肽。9.权利要求8所述的合成蛋白质的方法，其中氧化型谷胱甘肽的浓度为0到8mM。10.权利要求8或9所述的合成蛋白质的方法，其中二硫苏糖醇的浓度为0到1mM。11.权利要求1-10中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中硫氧还蛋白还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。12.权利要求1-11中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中谷胱甘肽还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。13.一种检测方法包括在包含以下a)，b)和c)和/或d)的反应体系中改变氧化还原酶试剂和氧化还原试剂的浓度；合成包含至少一个肽链的蛋白质，其中所述肽链分子内或分子间通过至少一个二硫键进行交联，其活性可根据这种交联方式进行调节；测定蛋白质的活性；及测定蛋白质活性、氧化还原酶试剂浓度和氧化还原试剂浓度之间的关系a)至少一个编码目标蛋白的模板核酸；b)包含具有特定存在量和纯度的多种组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；c)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。14.权利要求13所述的检测方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。15.权利要求13所述的检测方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。16.权利要求13-15中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶是催化促进和/或异构化蛋白质的二硫键的酶。17.权利要求13-16中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶包括蛋白质二硫键异构酶类(PDIs)或二硫键交换蛋白。18.权利要求13-17中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶是浓度为0μM到10μM的蛋白质二硫键异构酶类。19.权利要求13-18中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶是浓度为0μM到10μM的二硫键交换蛋白。20.权利要求13-19中任一项所述的检测方法，其中氧化还原试剂为二硫苏糖醇或氧化型谷胱甘肽。21.权利要求20所述的检测方法，其中氧化型谷胱甘肽的浓度为0到8mM。22.权利要求13-21中任一项所述的检测方法，其中硫氧还蛋白还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。23.权利要求13-21中任一项所述的检测方法，其中谷胱甘肽还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。24.一种测定催化促进和/或异构化蛋白质二硫键的酶的活性的方法，包括以下a)，b)和c)a)至少一个模板核酸；b)包含多种具有特定的化合物名称、存在量和纯度的组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成基本反应试剂；c)包含至少一种具有特定的化合物名称、存在量和纯度的组分、可调节氧化还原状态试剂的氧化还原试剂。25.权利要求24中测定活性的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。26.权利要求24中测定活性的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：桑田英文，
申请(专利权)人：株式会社后基因组研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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