一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法技术

一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，涉及一种表达基因的克隆。提供一种重复性高、假阳性低、快速实惠和获得的基因片段较长的快速特异扩增差异表达基因长片段的方法。步骤为：以总ＲＮＡ或ｍＲＮＡ为模板，ｄＴ－ＲＳＬ为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条ｃＤＮＡ链；ＰＣＲ扩增：第一条ｃＤＮＡ链经稀释后，与ｄＴ－ＲＳＬ引物和ＲＳＬ随机引物混合于ＰＣＲ管中退火，进行一个ＰＣＲ循环反应，合成第二条ｃＤＮＡ链，随后将ＰＣＲ反应体系中的ｄＴ－ＲＳＬ和ＲＳＬ随机引物分别与ｃＤＮＡ第二条链特异结合，经ＰＣＲ循环，扩增出特异的ＤＮＡ片段；取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增的产物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表达基因的克隆，尤其是涉及。
技术介绍
许多年以来，分离差异表达基因的方法仅限于差异筛选cDNA文库，直到1992年mRNA差异显示技术(Liang P，Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of thepolymerase chain reaction.Science，1992，257967-971)，第一次实现了同时很灵敏地检测到真核细胞中大部分的转录本。近些年来，在分离和克隆差异表达基因的功能基因组学研究中，国内外学者又发展了多种分析方法，如代表性差异分析、抑制消减杂交(Diatchenko L，Lau Y FC，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationA method for generating differentiallyregulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，936025-6030)和基因芯片技术等等。实践证明，这些方法的应用，取得了很多的成就，克隆了一系列的差异表达基因，均各具独特优点，但同时也具有其自身的缺陷，如有的假阳性高、有的产生的基因片段短、有的技术复杂成本高等(李斐雪，王雁玲.差异表达基因的高通量筛选方法.细胞生物学杂志，2004，26339-343；周延凯，周建林，聂东宋.筛选差异表达基因方法的新进展.生物技术通报，2004，15(6)620-622；李文雍，陈清轩.筛选差异表达基因的方法进展.阜阳师范学院学报，2004，21(1)1-6；徐德全，熊远著.差异表达基因克隆技术的研究进展.中国畜牧兽医，2004，31(3)31-34；谢伟伟，王凭青，杨青川等.植物差异表达基因克隆技术及研究进展.重庆大学学报，2005，28(12)96-100；肖朝庭，储明星，傅衍.几种基因差异表达筛选技术在动物发育与繁殖中的最新进展.中国畜牧兽医，2006，33(4)34-38)此外，引物退火时能否与其靶序列特异结合，是PCR能否成功扩增的关键因素之一，因此优化引物的结构是非常重要的。退火温度的高低决定引物是否能与其互补链完全结合，还是有一个或多个碱基错配，因此通过调整退火温度就可以增加引物与模板结合的特异性。许多研究者提出了各种办法来提高引物退火的特异性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段环状序列，以增加PCR扩增的特异性和杂交的稳定性(Brownie J，Shawcross S，TheakerJ，et al.The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucleic Acids Res，1997，253235-3241；Saiki R K，Walsh P S，Levenson C H，et al.Genetic analysis of amplified DNA withimmobilized sequence-specific oligonucleotide probes.Proc Natl Acad Sci USA，1989，866230-6234；Ailenberg M，Silverman M.Controlled hot start and improved specificity in carryingout PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers(TULIPS).BioTechniques，2000，291018-1024)，但这些方法并不能消除初始反应的非特异性杂交。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述方法所存在的不足，提供一种具有重复性高、假阳性低、快速实惠和获得的基因片段较长等特点的，特别有利于在非模式生物中克隆的快速特异扩增差异表达基因长片段的方法。 本专利技术的具体步骤为1)逆转录合成cDNA第一条链以总RNA或mRNA为模板，dT-RSL为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链；2)PCR扩增第一条cDNA链经稀释后，与dT-RSL引物和RSL随机引物混合于PCR管中退火，进行一个PCR循环反应，合成第二条cDNA链，随后将PCR反应体系中的dT-RSL和RSL随机引物分别与cDNA第二条链特异结合，经PCR循环，扩增出特异的DNA片段；3)结果检测取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物；4)采用普通方法割胶纯化差异表达基因片段，与T质粒载体连接，转入感受态细胞，对基因片段的序列进行测定和分析。 在步骤1所述的逆转录合成cDNA第一条链中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反应体系1～3μg总RNA(或0.1～0.3μgmRNA)，10μM dT-RSL2μL，加无RNA酶双蒸水至总体积12μL，混合均匀；70℃孵育2min，再在冰上冷却2min；往管中加入如下反应体系5×RTbuffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆转录酶(或其它逆转录酶)1μL，混合均匀；42℃孵育90min，再在94℃变性2min；合成的cDNA第一条链用无DNA酶双蒸水稀释10倍，置于-20℃备用。 在步骤2所述的PCR扩增中，是在PCR管中加入20μL如下反应体系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL随机引物1μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加无DNA酶双蒸水至总体积20μL，混合均匀；PCR扩增循环参数为94℃ 5min，50℃ 3～5min，72℃ 1～2min，1个循环；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40个循环；72℃，5min。 在步骤3中，所述的扩增产物取5uL，上样缓冲液取1μL。 本专利技术具有重复性高、假阳性低、快速实惠和获得的基因片段较长等优点，特别有利于在非模式生物中的快速特异扩增差异表达基因长片段。具体实施方式实施例1dT-RSL引物序列为5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTT TTT TTT TTT TTTTTT TTTT-3’RSL3随机引物序列为5’AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTI III ICC GGA GGATG-3’分别从对照组和副溶血弧菌诱导4h、1天和2天的大黄鱼肝脏中提取总RNA，每一时相各取1μg RNA等量混合后分为对照组和实验组总RNA。 1.逆转录合成cDNA第一条链1)分别在两个0.5mL的PCR管中，加入如下反应体系3μg总RNA(对照组或实验组)，10μM dT-RSL2μL，加无RNA酶双蒸水至总体积12μL，混合均匀。 2)70℃孵育2min，再在冰上冷却2min。 3)往两个管中分别加入如下反应体系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于其步骤为：１）逆转录合成ｃＤＮＡ第一条链：以总ＲＮＡ或ｍＲＮＡ为模板，ｄＴ－ＲＳＬ为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条ｃＤＮＡ链；２）ＰＣＲ扩增：第一条ｃＤＮＡ链经稀释后， 与ｄＴ－ＲＳＬ引物和ＲＳＬ随机引物混合于ＰＣＲ管中退火，进行一个ＰＣＲ循环反应，合成第二条ｃＤＮＡ链，随后将ＰＣＲ反应体系中的ｄＴ－ＲＳＬ和ＲＳＬ随机引物分别与ｃＤＮＡ第二条链特异结合，经ＰＣＲ循环，扩增出特异的ＤＮＡ片段；３）结果 检测：取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增的产物；４）采用普通方法割胶纯化差异表达基因片段，与Ｔ质粒载体连接，转入感受态细胞，对基因片段的序列进行测定和分析。

【技术特征摘要】
1.一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于其步骤为1)逆转录合成cDNA第一条链以总RNA或mRNA为模板，dT-RSL为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链；2)PCR扩增第一条cDNA链经稀释后，与dT-RSL引物和RSL随机引物混合于PCR管中退火，进行一个PCR循环反应，合成第二条cDNA链，随后将PCR反应体系中的dT-RSL和RSL随机引物分别与cDNA第二条链特异结合，经PCR循环，扩增出特异的DNA片段；3)结果检测取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物；4)采用普通方法割胶纯化差异表达基因片段，与T质粒载体连接，转入感受态细胞，对基因片段的序列进行测定和分析。2.如权利要求1所述的一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于在步骤1所述的逆转录合成cDNA第一条链中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反应体系1～3μg总RNA或0.1～0.3μg mRNA，10μM dT-RSL2μL，加无RNA酶双蒸水至总体积12μL，混合均匀；70℃孵育2min，再在冰上冷却2mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艺磊，张子平，谢芳靖，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]