本发明专利技术公开了一种基于ELISA检测DNA-蛋白交联体的方法，整合了细胞核抽提/裂解/Tris饱和酚回收的DPC提取、DPC中基因组DNA的SYBR Green Ⅰ定量、全能核酸酶消化基因组DNA以增强DPC中抗原在ELISA板上的包被能力等样品处理方法和技术。利用该方法，成功检测出O6-烷基转移酶(MGMT)在氮芥染毒后与DNA的交联体(M-DPC)显著增加，与文献报道一致。该方法快速、简便、灵敏，也可以应用于某些其它交联蛋白的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及一种与诊断相关的基于ELISA方法检测在某些理化因素作用下，直接或间接产生的DNA-蛋白交联物。
技术介绍
生物机体中，DNA-蛋白的相互作用，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、转录因子、DNA损伤修复蛋白等与基因组DNA非共价结合的相互作用(non-covalent interact1n)，在细胞增殖和维持遗传基因的完整性等方面发挥了重要作用。然而，药/毒物暴露下形成的共价结合(Covalent interact1n)的交联型 DNA-蛋白复合体(DNA-Protein crosslinkingcomplex，DPC)，由于阻碍了DNA的复制和转录，是一种严重的DNA损伤方式。甲醛，辐射，氮芥，顺铂等都可以引起DPC生成，并引起细胞增殖旺盛的组织，如骨髓、肿瘤等的药物敏感性增加(Wong VC,Cash HL,Morse JL,Lu S,Zhitkovich A: S-phase sensing of DNA-protein crosslinks triggers TopBP1-1ndependent ATR activat1n and p53_mediated cell death by formaldehyde.CelI Cycle 2012,11:2526-37.1de H，Shoulkamy MI,Nakano T,Miyamoto-Matsubara MjSalem AM:Repair and b1chemicaleffects of DNA-protein crosslinks.Mutat Res 2011，711:113-22.) dDPC致细胞损伤和基因突变的毒性效应已经得到确证(Nakano TjOuchi RjKawazoe JjPack SPjMakino K，Ide H:T7RNA polymerases backed up by covalently trapped proteins catalyzehighly error prone transcript1n.J B1l Chem 2012，287:6562-72.Nakano T，Mitsusada YjSalem AM,Shoulkamy MI,Sugimoto TjHirayama RjUzawa AjFurusawa Y，Ide H:1nduct1n of DNA-protein cross-links by 1nizing radiat1n and theireliminat1n from the genome.Mutat Res 2015，771:45—50.Nakano T,Miyamoto-Matsubara MjShoulkamy MI,Salem AMjPack SPjIshimi YjIde H:Translocat1n andstability of replicative DNA helicases upon encountering DNA-protein cross-links.J B1l Chem 2013,288:4649-58.)，近年来在DPC损伤修复机制上也有一些突破性的进展，如最近《Cell》发表文章，证实DPC可以通过复制依赖的水解酶修复(Duxin JPjDewar JM,Yardimci H,Wal ter JC: Repair of a DNA-protein crosslink byreplicat1n-coupled proteolysis.Cell 2014，159:346—57.Stingele JjSchwarz MS,Bloemeke NjWolf PGjJentsch S:A DNA-dependent protease involved in DNA-proteincrosslink repair.Cell 2014，158:327-38.)。但总的说来，DPC在作用机制尚有诸多不明之处。较其它的DNA损伤方式，如核酸碱基上加合烷化物、联间/内交联形成等，DPC引起的细胞损伤，突变效应更严重，修复更加困难。检测细胞或组织样本中总DPC(Total DPCJ-DPC)水平对于研究DPC的形成及细胞损伤修复机制，临床评估药物敏感性等有重要意义。06-甲基转移酶(06_me thy lguanine-DNA methy I transferase，MGMT)，一种 23kDa的蛋白，与DNA烷化损伤修复密切相关，是目前唯一发现的在哺乳细胞中能够直接移除06位点烃化加合物的修复酶，被认为在维持基因组稳定性和肿瘤形成中极为重要(Pegg AE:Multifaceted roles of alkyItransferase and related proteins in DNA repair,DNAdamage,resistance to chemotherapy，and research tools.Chem Res Toxicol 2011，24:618-39.) eMGMT是一种有限的消耗性酶，补充缓慢。MGMT在临床的肿瘤化疗，药物开发中均有重要作用。有报道，在造血组织高表达外源性MGMT可增加细胞对烷化剂的耐受(Schambach A,BayM C:Vector design for express1n of 06-methylguanine-DNAmethyItransferase in hematopoietic cells.DNA Repair(Amst)2007，6:1187-96.)。这说明MGMT表达水平与细胞的烷化剂耐受密切相关。我们的前期研究发现，在氮芥等双功能烷化剂作用后，MGMT无法发挥移除DNA加合物的正常功能，因为此时MGMT被交联在DNA上形成MGMT-DNA crosslink(M-DPC)无法释放。与其它的DPC损伤一样，M-DPC被证实具有致DNA复制损伤和突变的多重作用。在一些MGMT丰富的组织或细胞中，双功能烷化剂弓I起的M-DPC的增加被认为是动物/细胞毒性反应的重要原因(Kalapila AG1Pegg AE:AlkyItransferase-mediated toxicity of bis—electrophiIes in mammaliancells.Mutat Res 2010,684:35-42.Kisby GE,Olivas A,Park T1ChurchweII M,DoergeD,Samson LD,Gerson SL,Turker MS:DNA repair modulates the vulnerability of thedeveloping brain to alkylating agents.DNA Repair(Amst)2009,8:400-12.)。检测细胞或组织样本中M-DPC水平在此情况下有重要意义。虽然自上世纪70年代，人们就发现DPC存在于多种染毒组织、细胞中，但由于相关技术在普通实验室难以开展，针对DPC的检测难以应用，能够形成DPC的药物通常伴有大量的非DPC损伤，欲获得较高纯度的DPC样本通常需要使用超速离心等复杂手本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于ELISA检测DNA‑蛋白交联体的方法，包括如下步骤：(1)以DNA提取试剂提取DNA‑蛋白交联体混合物，以NaOH溶液溶解DNA‑蛋白交联体；(2)DNA‑蛋白交联体混合物中核酸浓度定量检测，(3)以定量的核酸浓度上样DNA‑蛋白交联体混合物，以全能核酸酶完全消化后，进行ELISA检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹仲敏，叶枫，程晋，赵吉清，但国蓉，赵远鹏，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。