一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法，属于基因工程领域。本发明专利技术的是将谷氨酰胺酶基因在16S rDNA、nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr 7个位点整合表达，最终得到了多位点无抗性整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM7。本发明专利技术得到的BSM1和BSM7，摇瓶发酵24h后，酶活分别为40.5U/mL和85.6U/mL，突变酶活提高了111.4％。BSM7菌株分批补料发酵，在32h左右达到最高酶活，为375.6U/mL。通过遗传稳定性分析发现，BSM7的遗传稳定性远远大于改基因的质粒表达的稳定性。该发明专利技术提高了谷氨酰胺酶酶在食品工业的应用潜力。

An unmarked multipoint integration expression of glutaminase and its construction method

The invention discloses an unmarked multipoint integration and expression of glutaminase strain and its construction method, which belongs to the field of genetic engineering. The present invention is to integrate the glutaminase gene expression in 16S, nprB, rDNA nprE, aprE, spo0A, EPR, BPR 7 sites, finally got a multilocus integrating expression of glutaminase without resistance strain BSM7. After the fermentation of BSM1 and BSM7, the enzyme activity was 40.5U/mL and 85.6U/mL respectively, and the activity of mutant enzyme was increased by 111.4%. The BSM7 strain was fed batch fermentation and reached the highest enzyme activity at about 32H, which was 375.6U/mL. The genetic stability analysis showed that the genetic stability of BSM7 was far greater than the stability of the plasmid expression of the modified gene. The invention improves the application potential of glutaminase in the food industry.

【技术实现步骤摘要】
一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法
本专利技术涉及一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法，属于基因工程

技术介绍
谷氨酰胺酶(glutaminase,EC3.5.1.2)能催化谷氨酰胺脱酰胺基水解形成谷氨酸和氨。近几年来，谷氨酰胺酶在食品和医学领域中应用研究发展迅速，有关这方面的报道也越来越多。通过研究如何减少癌细胞体内的谷氨酰胺酶含量或者活性，削弱癌细胞体内谷氨酰胺的代谢从而抑制肿瘤细胞的生长。谷氨酰胺酶在食品行业中的应用研究也很广泛，谷氨酰胺酶能够催化谷氨酰胺形成谷氨酸，谷氨酸在提高食品中的口感和风味方面具有很重要的作用。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，哺乳动物以及微生物中都发现含有谷氨酰胺酶。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一种枯草芽孢杆菌偏好性的谷氨酰胺酶核苷酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。本专利技术还提供了一种表达所述谷氨酰胺酶的基因工程菌。所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDNO.1所示序列的基础上，将包括16SrDNA两端同源臂，lox71-zeo-lox66和HpaII-Mglu的4个部分，通过重叠延伸的方法将4片段延伸成1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，以16SrDNA、nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr为整合位点，整合表达如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，以16SrDNA、nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr为整合位点，整合表达如SEQIDNO.1所示的基因序列。2.一种编码谷氨酰胺酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种谷氨酰胺酶，其特征在于，编码所述谷氨酰胺酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种制备权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，(1)16SrDNA位点整合表达片段的构建：将16SrDNA两端同源臂，lox71-zeo-lox66和HpaII-Mglu4个部分通过重叠延伸的方法延伸成1个片段，得到16SrDNA位点整合表达片段整合片段，将整合片段转化到宿主菌中，并将含有CRE重组酶的质粒转化入该宿主菌中，去除抗性标记，即得到无标记的16SrDNA位点整合表达谷氨酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌BSM1；(2)其他位点整合表达片段的构建：...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，徐朝阳，张显，杨套伟，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32