本发明专利技术涉及“一种乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ荧光定量检测方法和试剂盒”属于基因工程领域。一种乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ荧光定量检测方法，包括ＰＣＲ扩增反应体系，其特征在于：该ＰＣＲ体系包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物位置在ＨＢＶ基因组核苷酸序列１５２０－１５８０，下游引物位置在ＨＢＶ基因组核苷酸序列１９２０－２０００；探针位置在ＨＢＶ基因组核苷酸序列１８５０－１９００，探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团。该方法敏感度高，检测线形范围宽且节省试剂的消耗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法及试 剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染可以引起慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。我国HBV感染者约为 1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者约3500万，其中约20%的患者将发展为肝硬化， 约5 ~ 10%的患者将发生肝癌。目前国内、外尚无根治慢乙肝的有效药物和方法，因此，HBV 感染导致的慢性肝炎、肝硬化不仅严重地威胁我国人民的身心健康，而且还带来巨大的经济 负担。研究HBV，寻找能彻底治疗慢乙肝的治疗方法一直是我国传染病学领域的重大攻关课 题。慢乙肝的难治性与HBV复制的特殊性密切相关，乙肝病毒进入肝细胞后，在肝细胞浆内 脱去核衣壳，松弛环状DNA (relaxed circular virus DNA, RC-DNA)进入肝细胞核内，在 酶的作用下，将短链补齐，即成为共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)。病毒以cccDNA为摸板，在细胞浆中合成含有HBV全部遗传信息的前基因组RNA和 分子量不同的mRNA,再以前者为摸板先后合成HBV的正、负HBV链(Rc DNA)，并翻译各种病 毒的结构蛋白，最后在胞浆的内质网内组装病毒，从而完成整个病毒的复制。在细胞浆中复 制的新Rc DNA—方面可以合成新的乙肝病毒，另一方面可又进入细胞核，形成新的cccDNA。 所以cccDNA有两个来源， 一个是来源于血浆中的乙肝病毒， 一个是来源于自身复制出来的 Rc DNA。现有的抗病毒药物均是通过抑制或影响HBV DNA的合成而发挥其抗病毒作用，对HBV cccDNA作用极少， 一旦停止治疗，HBV很快又以cccDNA为摸板开始病毒DNA的复制，造成 肝细胞的持续炎症损伤，导致肝炎、肝硬化的发生。所以肝细胞核内一个稳定的cccDNA分子 池是HBV持续复制、感染肝细胞的根源，cccDNA的问题是解决慢乙肝治疗的关键之所在，也 是近年来乙型肝炎病毒研究的热点。乙型肝炎治疗终点的选择还很困难，长期用药不仅费用昂贵，还会诱发病毒变异导致耐 药等问题。目前，临床一般以HBV DNA小于103拷贝/毫升、ALT恢复正常和HBeAg血清学 转换为判断抗病毒治疗有效的标准，但是停药后大多数患者病情在l年内复发。因此，上述 指标不是判断抗病毒治疗应答及安全停药的理想指标。研究发现，在抗病毒治疗结束时，持久应答者肝内cccDNA显著低于非持久应答者，而外周血HBV DNA水平在持久应答者与非持 久应答者间无明显差异。以log cccDNA降到-0. 8每个肝细胞为抗病毒治疗停药指征，其 预测持久应答的敏感性为73 %，特异性为78 %，阳性率为56 %，准确率为77 %。以上结果 提示，肝组织内cccDNA的含量与抗病毒治疗远期疗效密切相关，对于抗病毒治疗远期疗效的 预测优于血清HBV DNA，有望成为判断慢性乙型肝炎抗病毒治疗终点的指标之一。cccDNA的 检测除了可以指导抗病毒治疗，对病情的诊断也有参考意义，有学者在肝炎活动的慢乙肝患 者外周血中检测到cccDNA，其与ALT的升高具有明显相关性，且早于ALT升高，因而，cccDNA 可以作为乙型肝炎肝损伤的早期标志。要研究HBV cccDNA，首先必须掌握检测cccDM的方法。由于cccDNA与Rc DNA的主要 区别在它是完整的双链环状DNA，而后者的环有部分的缺失，而且平均每个被感染的肝细胞 内仅含有10-25拷贝cccDNA分子，因此检测cccDNA具有一定的难度。以前对细胞内cccDNA 的了解不多也就是因为缺少特异的检测手段。传统cccDNA检测方法为Souther blot法，操 作繁琐，敏感性低，且不能准确定量，故难以在临床上应用。近20年来，由于PCR技术的出 现和发展，我们可以通过针对Rc DNA缺少的核苷酸序列设计引物，从而达到特异扩增cccDNA 的目的。目前cccDNA定量检测方法的研究在国外及香港开展得较多，但国内报道不多。本发 明人一直从事上述方法的研究，曾发表过cccDNA定量检测方法的文章，但该方法的灵敏度不 是很高，只有103-109拷贝/毫升，且序列标本DNA需要量为10ng/ml。
技术实现思路
针对上述领域中的缺陷，本专利技术提供一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，稳定 性好、灵敏度高以了解乙型肝炎病毒的复制情况，指导慢乙肝治疗方案的制定，评估抗病毒 药物的疗效和判定抗病毒治疗的终点，以期实现cccDNA定量检测的临床应用。同时本专利技术还提供一种使用该方法的试剂盒，以期真正实现cccDNA定量检测的临床应 用。因此，该方法的建立有着极为重要的临床应用价值和开发前景。一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，包括PCR扩增反应体系，其特征在于该 PCR体系包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物位置在HBV基因组核苷酸序列 1520-1580，下游引物位置在HBV基因组核苷酸序列1920—2000;探针位置在HBV基因组 核苷酸序列1850 —1900，探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团。所述PCR的上游引物序列为5， -cacctctctttacgcggtct-3，;下游引物序列为 5， -atacgggtcaatgtccatgc-3';探针序列为FAM TTCAAGCCTCCAAGCTGT 5NFQ。所述PCR扩增反应体系为10ng DNA样本，2^1 10xdNTP禾Q 0.5 U Taq DNA多聚酶， 上、下游引物各25ng、探针25ng，总体积20 ul。PCR扩增反应条件为94 °C预变性5 min， 94 。C 30 s、 60'C 1 min、 72'Clmin，循环35次，72°C延伸10 min。所述DNA样本来自血液或肝组织，模板总DNA浓度不低于5ng/ u 1 。一种乙型肝炎病毒cccDM荧光定量检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的PCR扩增反应体系。所述PCR扩增反应体系包括2pl 10xdNTP和0.5UTaqDNA多聚酶，上、下游引物、探 针各25ng。所述PCR扩增反应体系中检测的DNA样本来自血液或肝组织，模板总DNA浓度不低于 5ng/y 1o所述PCR扩增反应条件为94 。C预变性5 min, 94 。C 30 s、 60°C 1 min、 72。Clmin, 循环35次，72°C延伸10 min。HBV cccDNA分子池是朋V持续复制、感染肝细胞的根源，也是慢乙肝抗病毒停药后病情 反跳的重要原因之一，cccDNA定量扩增的难点在于区别cccDNA和rcDNA，两者在结构及理 化特性上有着很大区别，这种不同是cccDNA特异性检测方法建立的基础。基于此，我们对比 分析70条HBV A"G基因亚型序列，选择在基因保守区域设计引物和探针，使之具有更广泛 的代表性。HBV DNA基因组正负链缺口之间间隔223 bp，我们在两缺口之外的保守区域设计 引物、探针，扩增片段大小约为370 bp，保证了不同基因亚型的阳性检出率，同时实现了cccDNA 与rcDNA的区别扩增，达到特异性扩增cccDNA的目的。我们利用该方法对10" 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ荧光定量检测方法，包括ＰＣＲ扩增反应体系，其特征在于：该ＰＣＲ体系包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物位置在ＨＢＶ基因组核苷酸序列１５２０－－１５８０，下游引物位置在ＨＢＶ基因组核苷酸序列１９２０－２０００；探针位置在ＨＢＶ基因组核苷酸序列１８５０－－１９００，探针两端分别连接荧光基团和淬灭基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆海英，
申请(专利权)人：北京九州双博医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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