快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法。本方法运用凤仙花坏死斑病毒抗血清从表现同心圆褪绿斑症状的文心兰叶片上检测到凤仙花坏死斑病毒；利用凤仙花坏死斑病毒的特异性引物ＺＩ２Ｒ合成ｃＤＮＡ；运用合成的ｃＤＮＡ，分别以特异性引物ＺＩ２Ｆ／ＺＩ２Ｒ和ＺＩ１Ｆ／ＺＩ１Ｒ进行扩增，建立ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。本法还可对ＺＩ１Ｆ／ＺＩ１Ｒ扩增的ＰＣＲ产物再分别以ＺＩ１Ｆ／ＺＩ３Ｒ、ＺＩ３Ｆ／ＺＩ１Ｒ、ＺＩ３Ｆ／ＺＩ３Ｒ为内引物进行二次扩增，建立巢式ＰＣＲ检测方法。本发明专利技术灵敏性高，特异性好，为及时防治凤仙花坏死斑病毒对植株的侵害提供了有效的检测手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病毒检测
，更具体地说，本专利技术涉及文心兰种 苗的凤仙花坏死斑病毒的检测方法。
技术介绍
文心兰又名跳舞兰、金碟兰，是多年生草本花卉，原产中南美洲和北美 洲南部。以花色鲜艳，花型丰富而成为世界上重要的兰花品种之一。现世界 各地均有栽培。随着兰花种植范围的扩大和无性繁殖技术的应用，兰花上的病毒病的发生也日趋严重。已报道感染兰花的病毒病达27种，其中文心兰上 常见的病毒病是建兰花叶病毒(0^6/V/咖/i70w/c CyMV)和齿兰环斑 病毒(^/0/ "《A ^咖_r//^57 W 「/r〃s， 0RSV)。目前的研究主要集中在这两 种病毒检测上。近几年，番东斑萎病毒属(7bwow'/T^)病毒在我国台湾和 云南的兰花上出现，引起兰花叶片环斑，黄化。兰花的观赏价值和经济价值 遭到了严重影响。研究初步确定为番痴斑萎病毒属病毒但没有鉴定到种。凤仙花坏死斑病毒(//ff/73〃e/ 5" / ecro/7c s/7。f r/rw， INSV)是布尼亚病 毒科Ww^^/W&e)，番茄斑萎病毒属中发现的第二个病毒，传播介体为西 花蓟马，是番东斑萎病毒属中寄主范围较广，危害较大的病害。可侵染50 个科300多种植物，其中观赏植称占39个属、蔬菜占6个属，包括马蹄莲、 菊花、唐菖蒲、黄瓜、辣椒和莴苣等常见花卉和重要经济作物。ISNV引起的 症状多样，随寄主和侵染时期不同而变化，主要表现为矮化、环斑、叶片或 茎部的褐色至紫色的斑点、茎部变褐(溃疡)、碎色花，甚至植株死亡。综上所述，文心兰是兰花产业中主要的品种之一，侵染兰花的病毒种类 多，且目前研究主要针对常见的几种兰花病毒病害。另外，凤仙花坏死斑病 毒因寄主范围广，传播介体个体小，传播速度和繁殖速度快的特点易对兰花产业造成严重危害，这是一个迫切需要解决的技术难题。现有技术中尚未发 现相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，填补凤仙花坏死斑病毒检测方面 的空白，提供。 本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。本专利技术提供了，包括下述顺序的步骤(1)运用上海华舜的植物叶总RNA提取试剂盒从表现同心圆褪绿斑症 状的文心兰叶片上提取植物总RNA;(2 )利用凤仙花坏死斑病毒的特异性引物ZI2R把提取到的总RNA反转 录成cDNA;(3) 运用合成的cDNA,分别以特异性引物ZI2F/ZI2R和ZI1F/ZI1R进 行扩增，建立常规的PCR检测方法；(4) 对ZI1F/ZI1R扩增的PCR产物再分别以ZI1F/ZI3R、 ZI3F/ZI1R、 ZI3F/ZI3R为内引物进行二次扩增，建立巢式PCR检测方法。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果首次在文心兰植株上检测到凤仙花坏死斑病毒，也是首次在中国发现 该病毒，建立了凤仙花坏死斑病毒的liT-PCR和巢式PCR的检测方法。与常规的生物学方法相比，本专利技术的检测方法具有灵敏性高，特异性好等优点，本 专利技术中提到的特异性引物及PCR反应体系和反应程序能扩增出与预期片段大 小一致的目的条带。特别是当病毒含量少时，使用巢式PCR能在灵敏性和特 异性方面比常规RT-PCR有进一步的提高。本专利技术建立凤仙花坏死斑病毒的检 测方法对及时防治病毒对植株的侵害提供了有效的检测手段。附图说明图l受病毒侵害的文心兰上的症状；其中，(a)初期表现出褪绿圆斑 (b)逐渐表现出同心圆退绿斑(c)后期变成褐色坏死斑块；图2RT-PCR扩增产物经iyo琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，l.表现症 状的病斑处样品2.表现症状的远离病斑处的样品3.与病斑邻近的叶片 4.健康植株对照；图3N基因上539bp序列比对聚类图4巢式PCR;其中，1: ZI1F和ZI3R扩增产物；2: ZI3F和ZI1R扩 增产物；3: ZI3F和ZI3R ;图5常规PCR与巢式PCR灵敏性；其中，1-6:依次为1、 10、 l(T2、 10—3、 10"、 10-5倍稀释后的常规PCR; 7-12:依次为1、 10、 l(T、 l(T3、 10一4、 10-5倍稀释后的巢式PCR 。具体实施例方式下面结合附图与具体实施例对本技术作进一步详细描述。但它并不 是对本专利技术保护范围的限定。——RT-PCR检测从感病植株表现症状的部位、远离症状的叶尖和健康植株上取样，提取 植物总RM,合成cDNA后分别以ZI2F和ZI2R作为特异引物进行常规PCR扩 增。PCR反应体系25nL:上述反转录产物2pL、 10xPCR Buffer 3pL、 Mg2+(25raM)1.2iaL、 dNTP Mixture (各2. 5mM) 0. 4 y L、 ZI2F0. 4yL、 ZI2R0. 4 juL、 Taq酶(5U/yL) 0.2nL和灭菌水17.4juL。反应程序94°C 5min; 94°C 30s、 45°C 30s、 72。C 40s, 30个循环；72°C 8min。RT-PCR扩增产物经iy。琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2，表现症状 的叶片上经PCR扩增后，在500bp处可以看到与预期片段大小一致的目标条带 (见图2 ，泳道l， 2)。从未表现症状的叶片上也扩增出与预期片段大小一 致的目标条带(见图2，泳道3)。而阴性对照没有特异性扩增条带。(图2, 泳道4 )利用大连宝生物公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接于 pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性菌落，所 得重组质粒经酶切验证后，送大连宝生物公司测序。测序结果表明重组质粒 插入片段全长为539bp, BLAST序列分析该片段的核苷酸序列与已经报道的 INSV核苷酸序列同源性为99%。利用DNAMAN5. 2. 2软件对不同地区样品N基 因上的539bp序列分析发现，在所扩增的区域中国云南文心兰上INSV的分 离物(KMS6503 )与日本、意大利的分离物(GenBank登录号为AB109100、 A菌803和DQ425096 )同源性为99%,与美国、荷兰的分离物(GenBank登 录号分别为D00914、 DQ523597、 DQ523598和X66972)同源性为9 8 % (见 图3)。序列聚类结果表明中国云南文心兰上发现的INSV可能是由日本、意 大利传过来的。 实施例2一一巢式PCR检测以ZI1F和ZI1R为外引物进行第一轮PCR扩增，扩增产物分别以ZI1F 和ZI3R、 ZI3F和ZI1R、 ZI3F和ZI3R为内引物进行第二轮扩增。模板2yL、 10xPCR Buffer 3jaL、 Mg2+(25raM) 1. 2 n L、 dNTP Mixture (各2. 5mM) 0. 4 ja L、 上游引物0. 4jaL、下游引物0. 4juL、 Taq酶(5U/juL)0. 2juL和灭菌水17.4jjL。反应程序94°C 5min; 94°C 30s、 52°C 30s、 72°C 40s， 30个循环； 72°C 8min。同时将cDNA以10倍、10—2倍、10—3倍、10—4倍、10—5倍稀释后先用引物ZI1F 和ZI1R进行第一轮扩增，然后以ZI3F和ZI3R为引物进行第二轮扩增来验证巢 式PCR的敏感性。r/。琼脂糖凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　（１）运用上海华舜植物叶总ＲＮＡ提取试剂盒从表现同心圆褪绿斑症状的文心兰叶片上提取总ＲＮＡ；　　　　（２）利用凤仙花坏死斑病毒的特异性引物ＺＩ２Ｒ把提取到的总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ；　　　　（３）运用合成的ｃＤＮＡ，分别以特异性引物ＺＩ２Ｆ／ＺＩ２Ｒ和ＺＩ１Ｆ／ＺＩ１Ｒ进行扩增，建立ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁元明，张巧萍，刘毅，周剑，段禄华，和万忠，和捷，
申请(专利权)人：云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]