一种云芝糖肽（ＰＳＰ）的生产方法技术

本发明专利技术是一种云芝糖肽（ＰＳＰ）的生产方法。它采用通气发酵法，经６０～７０小时培养，从中国云芝ｃｏｖ－１菌株的菌丝体中，用热水浸取和醇析提取获得的一种具有抑制癌细胞与提高机体免疫功能的糖肽。试验证明：云芝糖肽（ＰＳＰ）能抑制人肺癌、胃癌、白血病、淋巴癌细胞及腹水癌等多种癌细胞的增生；并能显著提高负瘤者食欲，缓解疼痛，提高耐缺氧能力；消除因化疗或放疗引起的白血球降低作用，提高机体ＩｇＧ、补体Ｃ－［３］、溶血素ＨＣ－［５０］含量和吞＿＿指数。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种云芝糖肽(Polysaccharide-pepetideofCoriodevorsicolor简称PSP)的生产方法。自七十年代起，各国对真菌多糖及其生产方法研究甚多。研究成果表明，在担子菌纲多孔菌科中有众多的属、种能提取到具有抗癌活性的多糖。在1985年召开的第14届国际化疗会议上，属于这类抗癌多糖的研究文献就有68篇。查阅文献，已报导的专利共6篇。其中4篇涉及云芝菌株特性及培养基碳氮源比例与菌丝体产量的关系;涉及到从云芝深层培养菌丝体中提取抗癌多糖的专利有1977年的美国4051314专利和1981年的美国4289688专利2篇。其中，美国4051314专利的云芝深层培养基的碳源为麦芽膏，培养时间240小时，制得的有效成份是葡聚糖(Glucan);美国4289688专利介绍的云芝深层培养基的氮源为蛋白胨和酵母膏，但由于采用静止培养，培养时间需要600小时(25天)，其有效成份结合蛋白多糖(Proteinboundpolysaccharide)的提取采用硫酸铵盐析法，该产物抑制的瘤谱为动物Sarcoma-180和Ehrlich细胞。分析上述两项专利，尚存在以下不足之处培养时间长、培养基配方成本高、提取物抑瘤谱窄，也未见对人体癌细胞的抑癌作用。本专利技术旨在创造一种发酵时间短、培养基成本低廉、菌丝体内B组分高的云芝糖肽(PSP)的生产方法，从而获得一种具有广泛抑制人癌细胞与提高机体免疫功能的无毒免疫调节剂-云芝糖肽(PSP)。本专利技术方法采用如下技术、步骤实现专利技术任务。一、菌株的选育与特征本专利技术使用的菌株是从中国吉林、湖南、四川、广东、福建、云南、浙江、上海等地分离和蒐集的46株云芝(Coriolusversicolor)中经筛选、驯化而得到的一株优良菌株，它特别适合于深层发酵，在培养过程中会散发出浓郁的水果香味。其沉没菌丝体不是丝状而呈球状。中国云芝菌株Cov-1对培养基的适应性强，可用廉价原料作碳、氮源。所产糖肽能直接抑制人癌细胞的增殖。本专利技术使用的中国云芝菌株Cov-1，可用普通真菌筛选技术和液体深层培养、驯化技术在彩绒革盖菌〔Coriolusversicolor(Fr)Quel)中选育。二、菌株的培养本专利技术采用三级通气发酵法生产云芝菌丝体，因而发酵周期短，每次生产只需48-72小时。与静止培养法比，不仅生产规模大，时间也缩短5～10倍。本技术的生产流程如下 种子罐、繁殖罐和发酵罐的投料量为70%，接种量为10%，罐温24-30℃，通气量1∶0.5～1∶1.0(V/V)，搅拌转速100～200rpm。发酵氮源不用蛋白胨和酵母膏，碳源也不用麦芽膏，而是选用黄豆饼粉、花生饼粉和糖蜜。种子罐和繁殖罐的发酵时间为48小时，发酵罐的发酵时间为60～72小时。三、云芝糖肽(PSP)的提取从云芝菌丝体中提取抗癌多糖主要有盐析法(硫酸铵盐)和喷雾干燥法。前者需要经透析、脱盐，工艺复杂，不利于生产。后者方法虽简单，但所得产品因未经分离，成份混杂，糖肽含量低。本专利技术采用乙醇醇析法，即用1份云芝菌丝体热水提取浓缩液和3份95%食用乙醇，在0～4℃下沉淀8小时的方法提取云芝糖肽(PSP)。本方法简便，所得糖肽成份也较纯。四、云芝糖肽(PSP)的药效试验及慢性毒性试验用上述专利技术方法获得的云芝糖肽(PSP)抗癌活性强，不仅能抑制动物肿瘤(Sarcoma-180、Ehrlich细胞)的生长，且能抑制人肺癌、胃癌、单核细胞白血病和淋巴瘤的增殖。用标记前体掺入法测试，云芝糖肽(PSP)能阻抑Ehrlich腹水癌细胞RNA和DNA的合成。用体外培养法试验证明，云芝糖肽(PSP)能直接使人肺癌细胞发生畸变，如细胞核肿大、多核、染色质凝集、核膜粗糙等。下表1列举了云芝糖肽(PSP)对人和动物肿瘤细胞的抑制率。此外，用本方法获得的云芝糖肽(PSP)，还能明显地提高荷瘤机体的免疫球蛋白(IgG)、补体C3和血清溶血素(HC30)的含量。下表2列举了云芝糖肽(PSP)对荷瘤(S-180)小鼠免疫功能的影响。表1.PSP浓度作用时间肿瘤细胞抑制率%体外试验1mg/ml48小时人胃癌(7901)38.11mg/ml72小时人肺癌(CPC)39.41mg/ml72小时人淋巴瘤(SLY)39.51mg/ml72小时人白血病(MEL)63.51mg/ml72小时鼠白血病(P.388)96.32mg/ml60分钟Ehrlich腹水癌RNA合成80.32mg/ml120分钟Ehrlich腹水癌DNA合成38.5体内试验50μg/ml21天Sarcoma-18064(小鼠品(Cip×10)系、ICR)100μg/ml(PO×10)13天Sarcoma-18052表2.IgG(μg/10ml) 补体C3(μg/10ml) 血清溶血素(HC30)对照18±373±18316±100加PSP(1mg/kg、PO×10) 21±1＊95±12＊422±55＊＊＊表示P＜0.01＊＊表示P＜0.05云芝糖肽(PSP)对腹腔巨噬细胞的吞噬功能也有明显的促进作用。用注射环磷酰胺小鼠作试验，云芝糖肽(PSP)能抵抗由环磷酰胺引起的白血球降低和食欲减退的作用。用醋酸扭体法及热板法试验，云芝糖肽(PSP)有明显的镇痛效果。总之，用本方法获得的云芝糖肽(PSP)，不仅抑制人癌细胞增生，而且能降低和消除由化疗和放射治疗引起的毒副反应。云芝糖肽(PSP)的产生菌为无毒的中国云芝菌株Cov-1，生产所用培养基和乙醇溶剂均无毒性，后处理中的丙酮和无水乙醚是极易挥发的物质，云芝糖肽的成品中不会残留。经用哺乳动物灵长目猴子作慢性毒性试验证明，大剂量服用PSP半年，动物均无毒性反应。长期服用PSP的病人证明，PSP不仅不会产生任何毒副反应，反而能增强病员机体的抗癌免疫能力。本专利技术的一种云芝糖肽(PSP)的生产方法，能获得高活性的有抑制人癌细胞与提高负瘤机体免疫功能的云芝糖肽(PSP)，概括起来有以下六点特色和实用效果1.本专利技术的云芝糖肽(PSP)的生产方法，以中国云芝菌株Cov-1为菌种，采用通气发酵法，能在2-3天内培养大量云芝菌丝体，比静止培养法10-25天快5-8倍。2.本专利技术采用黄豆饼粉、花生饼粉等廉价原料代替昂贵的蛋白胨、酵母膏作氮源，大大降低了生产成本。3.本专利技术采用醇析法提取抗癌多糖，比用硫酸铵盐析法提取的工艺更为简化，比用喷雾干燥法所得的产品成份更纯。4.本专利技术用Cov-1菌株生产的云芝糖肽(PSP)含有较多的B组分，不仅能抑制动物肿瘤细胞，而且能抑制人肺癌、胃癌、淋巴瘤及单核细胞白血球病等细胞的增生。5.用本专利技术方法获得的云芝糖肽(PSP)能明显提高机体抗癌免疫能力，增强吞噬功能，提高耐缺氧能力，提高IgG、补体C3、溶血素HC30值及白血球数。6.用本专利技术方法获得的云芝糖肽(PSP)，能明显降低化疗放疗引起的毒副反应，提高食欲，缓解疼痛，提高耐缺氧能力。下面提供本专利技术方法的三个实施例，以进一步阐述专利技术方法的技术与步骤。实施例1.取用液氮保存的中国云芝Cov-1菌株，移植在PDA斜面培养基上，25℃培育10天。PDA配方如下马铃薯煮汁＊960ml葡萄糖20g琼脂20gpH6.5＊去皮马铃薯200g，加水煮沸5分钟后取汁。灭菌1.2kg/c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抑制人癌细胞与提高负瘤机体免疫功能的云芝糖肽（ＰＳＰ）生产方法，其特征在于：（１）．生产菌株Ｃｏｖ－１是从中国和各地分离的４６株云芝（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ－ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）中经筛选、驯化后获得的一株优良菌株，其适宜于通气发酵培 养，培养过程中会散发出浓郁的水果香味，其沉没菌丝呈球状。（２）．把（１）所述的Ｃｏｖ－１菌株逐级引入通气发酵罐，通气量为１∶０．５～１∶１．０（ｖ／ｖ），搅拌速度为１００～２００ｒｐｍ，发酵时间为６０～７２小时。（３）．按（１）所述 的菌株Ｃｏｖ－１在通气发酵中是从黄豆饼粉或花生饼粉为氮源；以糖蜜和葡萄糖为碳源。（４）．按（２）、（３）所述的培养物过滤得菌株Ｃｏｖ－１的菌丝体，破碎后，在９０～１００℃热水中回流浸取３～５小时，得到菌丝体浸取液。（５）．由（４）得 到的浸取液经浓缩后，用１：３－４（ｖ／ｖ）比例的乙醇在０～４℃温度下醇析６～８小时，得醇析物。（６）．由（５）得到的醇析物经干燥处理，即可获得褐色粉末状的云芝糖肽（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｐｅｐｅｔｉｄｅ－ｏｆ－＊＊＊简称ＰＳＰ） 。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨庆尧，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]