具有高艾杜糖醛酸含量的多糖类制造技术

本发明专利技术提供了制备具有高含量艾杜糖醛酸的多糖的方法，包括：ａ）Ｎ－脱乙酰化从大肠杆菌得到的多糖Ｋ５或硫酰乙酰肝素，或者Ｏ－脱硫酸盐化肝素或硫酸乙酰肝素；ｂ）Ｎ－硫酸盐化ａ）部所得产物；ｃ）在Ｃ５差向异构酶存在下进行差向异构化；ｄ）将至少某些游离羟基进行硫酸盐化，其特征是步骤ｃ）是在由ＨＥＰＥＳ、氯化钾和ＥＤＴＡ形成的经典缓冲溶液，和ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００构成的并加有适当添加剂的反应介质中进行。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
现有技术葡糖胺聚糖属于含有艾杜糖醛酸的多糖类物质，它们从不同来源的动物组织提取得到，这些组织如肠粘膜，肺等。肝素，硫酸乙酰肝素，condroitin sulfates和透明质酸属于葡糖胺聚糖族系。不同的葡糖胺聚糖具有不相同的化学结构，它们由糖醛酸和己糖胺重复构成的多糖链形成。具体讲，在肝素和硫酸乙酰肝素中，糖醛酸(uronicacid)由糖醛酸(glycuronic acid)或艾杜糖醛酸构成，而己糖胺则由葡糖胺构成。葡糖胺可优先被N-乙酰化(硫酸乙酰肝素)或优先N-硫酸盐化(肝素)和6-O硫酸盐化。此外，还发现在葡糖胺的3位上也带有硫酸根。糖醛酸可被2-O硫酸盐化。在临床实践中，肝素作为抗凝血剂和抗血栓形成剂具有十分重要的作用。对肝素和硫酸乙酰肝素来讲，除上述这种治疗应用外，还希望它们在若干其它病理学方面具有有用的应用，例如具有抗血脂，抗增生，抗病毒，抗肿瘤和抗生成血管功能等作用。肝素和硫酸乙酰肝素在这些新治疗应用方面的使用包括必需用不同于提取的方法，特别是用适应性更强的可以制备不同结构产物的方法，制得这些产物或类似产物。并且，提取动物组织的方法不能保证得到无病毒产物。WO92/17507专利申请中描述了通过生物合成制备抗凝血剂葡糖胺聚糖的方法。在此方法中，使用从大肠杆菌中得到的多糖K5为原料，采用下述反应顺序进行-N-脱乙酰化作用；-N-硫酸盐化作用；-差向异构作用，以便将D-糖醛酸的至少某些残基转移到L-艾杜糖醛酸的残基上；和-至少某些游离羟基的硫酸盐化作用。此方法中，其关键步骤在于差向异构作用，这种差向异构作用最多限于20％。差向异构是在由HEPES、氯化钾、EDTA和TRITON X-100组成的pH为7.4的经典反应介质中，于D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向异构酶(D-glycuronyl-L-iduronyl-C5-epimerase)存在下室温进行两天。以前已阐述了限于三分之一糖醛酸差向异构作用(M.Hook等人，生物化学(The J.of Biol.Chem.)249，123908-3915，1974年6月25日)。并且这种差向异构程度似乎至今仍是无法逾越的。此外，必须注意的是，在此文献中，细胞环境中的差向异构作用是在生物合成方法的各种因素存在的条件下于鼠肥大细胞瘤中进行。但是，象从现有技术中得到的差向异构程度不允许得到具有各种治疗应用所需特征的产物。事实上，艾杜糖醛酸赋予糖醛酸产物优越的柔性(Casu B.，Petitou M.，Provasoli M.，和Sinay P.(1988)构象柔性一种解释包含艾杜糖醛酸的葡糖胺聚糖结合和生物特性的新概念。Trends Biochem.Sci.13，221-225)。因此，正如由肝素相对于硫酸乙酰肝素具有更强的抗凝和抗血栓形成活性和其它活性如对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的活性所指出的那样，含有高百分比量艾杜糖醛酸的产物较之那些含有糖醛酸的产物具有更高活性，其中艾杜糖醛酸被认为是活性部位的必需部分(Maccarana M.，Casu B，.和Lindahl U.(1993).结合碱性成纤维细胞生长因子所需要的肝素/硫酸乙酰肝素中的最低序列(Minimal sequence in Heparin/Heparan SulfateRequired for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor).生物化学(J.Biol.Chem.)，268，23898-23905)。因此，从工业角度来看，存在着这样难题，即寻求能得到具有可接受的产率和时间的高度差向异构作用的产物的方法。概述我们已发现，具有高艾杜糖醛酸含量的多糖类可通过下述方法以由大肠杆菌得到的多糖K5或以肝素或硫酸乙酰肝素为原料制得，该方法包括a)N-脱乙酰化所述多糖K5或硫酸乙酰肝素，或者O-脱硫酸盐化肝素或硫酸乙酰肝素；b) N-硫酸盐化a)步所得产物；c)在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5差向异构酶存在下进行一次或多次差向异构处理；d)将至少某些游离羟基进行硫酸盐化，其特征在于差向异构步骤是在由由HEPES、氯化钾和EDTA形成的pH为7.4的经典缓冲溶液构成的、加有TRITON X-100和一种或多种选自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰胆碱的添加剂的反应介质中进行。按照本专利技术方法，可以制得相对于糖醛酸总含量，艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖。专利技术详述下文详尽的说明过程中基本上完全指出了本专利技术方法和所得多糖的特征及优点。按Manzoni M.，Bergomi S.，Cavazzoni V.(生物活性和相容聚合物(Journal of Bioactive and Compatible Polymers).Vol VIII，1993年7月，251-257)所述由大肠杆菌得到的多糖K5特别适合用作本专利技术方法的起始原料。肝素和硫酸乙酰肝素也可用作第一步中操作条件有某些改变的本专利技术方法的起始原料。起始原料可以具有2,000至大于50,000D的分子量。当使用多糖K5时，其结构首先通过N-脱乙酰化改性，这种改性可通过用肼和硫酸肼混合物处理来进行，或者在碱性环境中通过用氢氧化钠或氢氧化钾处理进行。然后通过用三乙胺-三氧化硫或用三甲胺-三氧化硫处理，进行N-硫酸盐化。利用这些操作，可以得到各种，例如25％至100％的N-硫酸盐化产物。N-脱乙酰化和N-硫酸盐化的反应按照已知技术进行，例如按照WO92/17507中所述方法进行。当使用肝素作为起始原料时，先进行O-脱硫酸盐化，然后进行N-硫酸盐化，以便再硫酸盐化O-脱硫酸盐化作用期间脱去硫酸根的氨基位置。当硫酸乙酰肝素被用作起始原料时，不仅进行N-脱乙酰化和O-脱硫酸盐化，而且还进行形成N-再硫酸盐化。按上所述由多糖K5或硫酸乙酰肝素得到的N-硫酸盐化产物进行差向异构处理，以转化糖醛酸成艾杜糖醛酸，另一方面，为了由艾杜糖醛酸得到糖醛酸，则可用酶处理由肝素得到的产物。差向异构作用是在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向异构酶(以下用C5差向异构酶简单表示)进行，这种酶是从猫肝脏中提取出并按A.Malmstron在J.B.C 255，3878-3883(1980)中所述方法纯化得到。本申请人惊奇地发现，用适当添加剂改性经典反应介质，能获得非常高程度的差向异构作用。本专利技术的反应介质为由HEPES，氯化钾，EDTA和TRITON X-100构成的pH为7.4的缓冲溶液，并加有一种或多种选自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，特别是具有15,000至90,000分子量的聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰胆碱的添加剂，其加入量为适于增加缓冲溶液粘度至1.1至3厘沲的量。具体讲，所述反应介质由下述pH为7.4的缓冲溶液制备HEPES0.04M，KCl 0.4M和EDTA 0.06M，并向25ml此缓冲溶液中加入100至1000μlTRITON X-100，0.5ml至60ml添加剂，并加蒸馏水至100ml。将进行差向异构作用的多糖加到所述反应介质中，其加入量为每100ml反应介质5至1000mg，得到溶液A。将C5差向异构酶独立加到与上所述相同的反应介质中，其量为每100ml反应介本文档来自技高网...

【技术保护点】
以大肠杆菌得到的多糖Ｋ５或由肝素或硫酸乙酰肝素为原料，制备相对于糖醛酸总含量，Ｌ－艾杜糖醛酸含量大于５０％的多糖的方法。该方法包括：ａ）Ｎ－脱乙酰化所述多糖Ｋ５或硫酸乙酰肝素，或者Ｏ－脱硫酸盐化肝素或硫酸乙酰肝素；ｂ）Ｎ－硫酸盐化ａ ）步所得产物；ｃ）在Ｃ５差向异构酶存在下进行一次或多次差向异构处理；ｄ）将至少某些游离羟基进行硫酸盐化，其特征是差向异构步骤是在由由ＨＥＰＥＳ、氯化钾和ＥＤＴＡ构成的ｐＨ为７．４的经典缓冲溶液组成的、加有适于增加所述缓冲溶液的粘度值 至１．１至３厘沲量的ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００和一种或多种添加剂的反应介质中进行。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G佐派逖，P奥里斯特，G希波莱逖，
申请(专利权)人：伊纳尔科公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]