高效广谱抑制肿瘤生长和转移的新型抗体制造技术

本发明专利技术是利用生物技术研制出的一类抑制肿瘤生长和转移的新型抗体。本发明专利技术包括：鼠单克隆抗体ＡＡ９８，人－鼠嵌合抗体ＣｈｉＡＡ９８，和抗体ＡＡ９８和Ｆａｂ和Ｆｖ功能片段。这类抗体的特点在于特异识别肿瘤新生血管，具有诱发ＡＤＣＣ和ＣＤＣ的能力，特异而广谱地抑制肿瘤的生长和转移。这些抗体本身或抗体结合物都将成为具有广谱抗癌作用的高效低毒新型药物。同时也可用于肿瘤的早期诊断，以及肿瘤与其血管相互作用的基础研究。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和抗体工程
具体地说，本专利技术涉及一类能够特异识别大多数常见的人体肿瘤新生血管并抑制肿瘤生长和转移的新型抗体。癌症是当前危害人类生命健康的头号杀手。我国每年恶性肿瘤的发病人数约160万。死于癌症者占死亡总人数的20％以上，居城市居民死亡原因的第一位(根据1996年统计资料)。在肿瘤三大常规(放疗，化疗和手术>治疗中，药物治疗是一个重要方面。目前影响肿瘤药物治疗效果的因素是多方面的，包括药物的特异性、运输方式、渗透性以及诱发肿瘤耐药性。其中药物的特异性和耐药性是肿瘤治疗学急需解决的关键问题。本专利技术的特色在于它是一类肿瘤特异的、广谱的、无或低耐药性的新型抗癌药物。本专利技术所采取的策略是通过阻断肿瘤细胞的生命线-营养和血液供应，从而使肿瘤细胞缺血坏死。这种抗癌新策略是基于两点理论①肿瘤依赖于血管而生长的理论。②肿瘤新生血管既不象肿瘤细胞那样缺乏遗传稳定性，又不同于正常血管。正常血管内皮的更新需要100多天，而肿瘤血管仅需数天，且带有一些正常血管内皮所没有的新标志物。这些肿瘤血管特有的标志物是肿瘤药物筛选的新的靶标。本专利技术与传统的抗肿瘤抗体相比，其特点在于广谱、特异、高效、不易产生耐药性。作用机理如下，①肿瘤血管内皮细胞相对比较稳定，突变少，因而不会象肿瘤细胞那样易于产生耐药性；②不同类型实体瘤的特异靶分子不同，而它们赖以生存的新生血管结构大致相同，因此抗肿瘤新生血管抗体具有广谱性；③成千上万个肿瘤细胞依赖于一条毛细血管获取氧和营养物质，即使少量药物对于血管的不完全破坏，亦会造成血栓形成，导致大量肿瘤细胞缺血死亡。因此，本专利技术用药量少，效率高；④肿瘤血管药物直接作用于血管内皮，无需穿透到肿瘤深部，避免了肿瘤组织局部高压所引起的药物渗透和分布问题。通过文献和IBM专利数据库查询新生血管抑制剂(angiogenesisinhibitor)和新生血管抗体(angiogenesis antibody)，未见与本专利技术有关的文献和专利发表。本专利技术涉及一类作用于人体肿瘤血管的新型抗体，包括鼠单克隆抗体AA98和人-鼠嵌合抗体chiAA98以及小分子功能抗体AA98-Fab和AA98-scFv，它们作用于各种肿瘤血管，包括肝癌，胃癌，大肠癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌及平滑肌肉瘤，而对正常组织几乎不发生任何反应。单克隆抗体本身或抗体结合物均具有抑制多种人体肿瘤生长的作用。本专利技术与其它抗体比较，具有独特的优点第一，特异抗体识别肿瘤组织而非正常组织，这种高度特异性将在临床应用中大大减少药物的毒付作用。第二，广谱不同类型实体瘤细胞含有不同的特异抗原，如乳腺癌抗原不同与结肠癌抗原；但是肿瘤生长都需要刺激周围新生血管形成以提供肿瘤疯狂生长的营养。虽然肿瘤组织不同，而肿瘤刺激增生的新生血管都具有一些共同的特征，本专利技术就是针对这些共同特征而研制的，因此它的抗癌作用是广谱的。第三，高效抗体可根据其结构特点分为五类，大多数仅具有识别功能，少数不仅具有识别功能还具有杀伤作用。本专利技术单克隆抗体属于IgG2a亚型，是一种罕见的杀伤性抗体。它本身即可单独杀死癌细胞，其作用机理是由于某些抗体在人体效应细胞和血清存在下，具有诱发抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)，从而杀死肿瘤细胞。第四，抗体对肿瘤新生血管的高度选择性是由于它们所识别的靶抗原特异分布于新生血管内皮，参与肿瘤的生长和转移。第五，抗体及其结合物是一类具有广谱、高效、低毒、低耐药性的新型抗肿瘤药物。第六，抗体可用于肿瘤的诊断及定位，通过体内外方法检测癌症。第七，抗体作为一种良好的研究工具，用于研究新生血管形成及其与肿瘤生长和转移的相互作用。本专利技术在技术路线方面的创新之处在于①采用肿瘤细胞培养上清诱导人脐静脉内皮细胞，使其成为增殖的血管内皮细胞。后者用于免疫小鼠获得单克隆抗体AA98。这种新方法不仅提高了增生血管内皮细胞标志的丰度，维持了细胞膜抗原的天然构象，而且还可以发现新的靶分子。②利用现代分子生物学和抗体工程技术，研制出各种不同结构形式的基因工程抗体。这些抗体比原代鼠单克隆抗体具有更大的应用价值，主要表现在免疫源性较低、毒副作用小；易于与其它功能分子结合形成高效的免疫复合物；抗体基因易于保存并有利于进行抗体结构与功能的改造，以更好地适应于临床应用。本专利技术包括一套识别肿瘤血管的单克隆抗体及基因工程抗体，后者包括嵌合抗体，抗体Fab和单链抗体。其中单克隆抗体及嵌合抗体都具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，这是它们体内抗癌作用的基础。这些抗体本身就具有治疗作用。而抗体Fab和单链抗体在体内不显示ADCC和CDC活性，可用于载体，连接化疗药物、毒素、细胞因子、酶和放射性同位素。因此，这些小分子抗体可作为各种免疫结合物的成分之一，用于肿瘤的诊断和治疗。为了更全面地理解和应用本专利技术，提供下列实施例。实施例一单克隆抗体AA98的制备和鉴定应用杂交瘤技术生产单克隆抗体AA98(Kohler and Milstein,Nature2 56:495,1975；Yeh et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979；Yeh etal.,Int.J.Cancer,1982)。简述如下采用肝癌细胞的培养上清诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增生，以增生的HUVEC作为免疫原对BALB/C小鼠进行五次免疫接种。每次接种部位为腹膜内注射和皮下注射。每次注射的细胞总数大约为107。在最后一次免疫接种三天后，取脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和P3-X63-Ag8.635鼠骨髓瘤细胞进行融合，并用HAT选择性培养基对杂交瘤进行筛选。运用Douillard,et al.,Enzyme-linked Immunosorbent Assay forScreening monoclonal antibody production using enzyme-labeledsecond antibody,Meth.Enzymol,.92:168-74,1983介绍的方法，将细胞接种到96孔培养板内培养过夜。用新鲜配置的0.5％的戊二醛固定细胞15分钟，用PBS洗三遍。加入牛血清白蛋白封闭1小时。然后先后加入分泌抗体的杂交瘤培养上清，酶标抗体和底物。通过ELISA反复筛选，最后获得与增生HUVEC发生特异反应的高亲和力的抗体。用稀释法多次克隆分泌特异抗体AA98的杂交瘤细胞HE2A5。大量培养扩增杂交瘤细胞HE2A5，收集含有抗体AA98的培养上清用于抗体功能鉴定。另外将杂交瘤细胞HE2A5制成细胞悬液，用于制备抗体腹水。腹水的制备方法简述如下六周龄BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Pri stane)0.5ml/只。10天后，将杂交瘤细胞悬液接种于BALB/C小鼠腹腔，1×107/ml/只，十天后，收集腹水，离心取上清。通过蛋白A亲和层析，从培养上清或腹水中纯化单克隆抗体。将纯化单克隆抗体无菌过滤，并冷藏或冷冻保存。应用Zymed公司抗体亚型鉴定试剂盒，ELISA方法鉴定出抗体AA98属于IgG同型抗体。利用冷冻组织切片和免疫组化方法(Immunology 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类对新生血管具有特异反应的抗体及其功能片段，其特征在于：这类抗体包含杂交瘤单克隆抗体和基因工程抗体，它们能够特异识别新生血管内皮细胞膜抗原，具有诱发ＡＤＣＣ和ＣＤＣ的能力，这类抗体本身及其结合物均可以抑制新生血管的形成，具有特异而广谱的抗癌作用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阎锡蕴，袁玖，李力，吴小平，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]