生产嘌呤核苷酸的方法技术

本发明专利技术提供了生产嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的ＤＮＡ，所述ＤＮＡ可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；使所述嘌呤核苷酸前体在培养基中积累；诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前体形成嘌呤核苷酸并在所述培养基中积累；从培养基中回收所述嘌呤核苷酸。本发明专利技术还提供了可用于所述方法的微生物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生产作为调味剂被大量需求的嘌呤核苷酸的方法，以及对所述方法有用的微生物。5’-鸟苷酸(下文简称为GMP)和5’-肌苷酸(下文简称为IMP)是表现出强的增味活性的嘌呤核苷酸，其被广泛用作化学调味成分。已知一些生产上述增味核苷酸的方法例如，包括用核糖核酸酶P1水解提取自酵母细胞的RNA，然后分离和纯化所需的5’核苷酸的方法；通过使用具有生产IMP之能力的微生物进行发酵以直接生产IMP的方法；包括通过化学磷酸化将如肌苷和鸟苷的核苷转变为核苷酸的方法；包括使用巨大芽孢杆菌的突变体进行发酵以生产5-氨基-4-咪唑氨甲酰核苷(下文简称为AICAR)，然后通过化学合成由AICAR生产核苷酸的方法；和包括在培养基中培养生产5’-黄苷酸(下文简称为XMP)的产氨棒状杆菌突变体以形成和积累XMP，培养经自身-克隆使其XMP氨基酶(GMP合成酶)活性增强的大肠杆菌，然后使用经培养的大肠杆菌细胞作为酶源，通过酶反应由XMP生产GMP的方法。总的说来，迄今为止已开发的生产增味核苷酸的方法在原理上可分为三类(1)酵母RNA被得自微生物的酶降解或被化学降解的方法(RNA降解法)，(2)通过在含有糖，氮源和磷酸源的培养基中培养微生物的突变体以直接生产核苷酸的方法(直接发酵法)，和(3)包括通过发酵生产核苷酸合成所用的中间体，并通过化学或酶学方法将所述中间体转变为核苷酸的方法(该方法是发酵和化学合成或酶促转变的联合)。在RNA降解法(上文方法(1))中，所产生的嘧啶核苷酸的量与增味的嘌呤核苷酸的量几乎相同，因此，必需的纯化步骤变得复杂。在直接发酵法(上文方法(2))中，由于核苷酸的膜透性低，难以培养能在细胞外形成和积累相当量的核苷酸的微生物，因此难以获得在经济上令人满意的核苷酸生产能力。具体地说，迄今为止还没有一种方法可以直接生产GMP。然而，已知XMP可例外地大量形成和积累。目前，在经济上有利的生产增味核苷酸的方法是发酵和化学合成或酶促转变的联合(方法(3))，该方法可广泛用于工业化生产核苷酸。在此联合方法中，改善整个生产能力的一个要点是增加发酵步骤(此方法的第一阶段)中核苷酸合成所用中间体的产量。为此，培养了大量具有高的XMP，鸟苷或肌苷生产能力的微生物。已开发了多种将中间体化学或酶学转变为核苷酸的方法(此方法的第二阶段)。关于化学方法，在工业上使用的是位点特异性磷酸化反应(核苷至5’-核苷酸)。然而，化学磷酸化反应需要中间步骤以将作为磷酸基团受体的核苷纯化至必需的程度，除了用于发酵步骤发酵罐外还需要使用化学反应容器。因此，作为替代方法，人们注意到使用氨基酶或磷酸化酶的酶法，并对其进行了研究。至于氨基化，使用XMP氨基酶的方法是已知的。至于磷酸化，使用磷酸转移酶，激酶和磷酸酶的方法是已知的。特别是已证明使用激酶或磷酸酶的反应是有效的方法。例如，已开发了一种通过使用大肠杆菌菌株生产5’-核苷酸的方法，该菌株携有编码大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶的基因(WO91/08286)；还开发了一种通过使用产氨棒状杆菌菌株生产5’-核苷酸的方法，该菌株携有编码乙酰微小杆菌肌苷-鸟苷激酶的基因(WO96/30501)；和另一种通过使用大肠杆菌菌株生产5’-核苷酸的方法，该菌株携有通过将随机突变引入摩氏摩根氏菌的磷酸酶基因而制备的基因。至于磷酸基团供体，已研究了多种化合物。例如，使用下列物质的方法是已知的P-硝基苯基磷酸(日本公开未审专利申请2985/64)，无机磷酸(日本公开未审专利申请1186/67，日本公开未审专利申请44350/74)，多聚磷酸(日本公开未审专利申请56390/78)，乙酰磷酸(日本公开未审专利申请82098/81)，ATP(日本公开未审专利申请230094/88)，多聚磷酸，苯基磷酸和氨甲酰磷酸(日本公开未审专利申请37785/97)和焦磷酸(日本公开未审专利申请37785/97，日本公开未审专利申请201481/98)。然而，由于所用的底物是昂贵的或不稳定的，而且因产物反应的形成使得纯化步骤变得复杂等，这些方法在工业上无利可图。有关符合经济需求的实用方法，已开发了使用ATP-再生系统的核苷酸生产系统。在此系统中，微生物在糖类代谢的过程中利用无机磷酸由AMP或ADP再生ATP。例如，已建议使用一种方法，其中可生产XMP的微生物所具有的通过代谢葡萄糖以生物合成ATP的活性被用作ATP再生系统。多篇文献教导了使用便宜的葡萄糖和无机磷酸作为ATP再生底物而不是使用ATP生产GMP的方法，该方法中将上述ATP-再生系统与能由XMP和ATP形成GMP的微生物的XMP氨基酶活性相结合，类似的方法使用肌苷激酶作为酶以生产IMP(日本公开未审专利申请230094/88)。用于生产GMP或IMP的方法中使用了两种微生物，所述方法包括通过直接发酵生产XMP，鸟苷或肌苷的发酵步骤，和将发酵产物酶促转变为GMP或IMP的反应步骤。即，在作为该方法第一阶段的发酵步骤中，将突变体培养物用作生产XMP-，鸟苷-或肌苷-的微生物(生产微生物)。在作为该方法第二阶段的氨基化或磷酸化的反应步骤中，使用了携有高表达基因的微生物(转变微生物)，所述基因编码的蛋白质具有XMP氨基酶活性或肌苷-鸟苷激酶活性。通过第二阶段所用的转变微生物和第一阶段所用的生产微生物的ATP再生活性，可再生第二阶段反应所必需的ATP。因此，第二阶段的反应步骤是将XMP氨基酶活性或肌苷-鸟苷激酶活性与两种微生物的ATP再生活性相结合的系统。整个方法的概况将在下文描述。首先，在大发酵罐中，在主要含有糖和氮源的培养基中培养生产微生物以形成和积累XMP，鸟苷或肌苷。另外，在小发酵罐中培养转变微生物。当第一阶段的发酵完成之后，将分开培养的转变微生物加入大发酵罐中以在便宜的能量供体和磷酸基团供体的存在下进行磷酸化反应或氨基化反应。相对于上述化学磷酸化方法而言，利用酶反应的上述方法是有利的。然而，该方法的效率仍不能令人十分满意，因为培养转变微生物必需小发酵罐，考虑到需加入转变微生物，第一阶段的发酵步骤所用的培养基必需减少，这会减少每批所得的所需核苷酸的量。本专利技术的目的是开发一种能在一个发酵罐中有效。本专利技术人寻求开发更好的生产嘌呤核苷酸之方法的可能性，该方法通过将能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的基因导入能生产嘌呤核苷酸前体的发酵微生物中，并调节该基因在发酵步骤和反应步骤中的表达，可仅在一个发酵罐中使用一种微生物依次进行生产核苷酸前体的发酵过程和将所述前体转变为核苷酸的反应。在寻求可能性的过程中进行了创造性的研究，结果完成了本专利技术。本专利技术涉及下列(1)-(19)。(1)，所述方法包括在培养基中培养微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的DNA，所述DNA可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；使所述的嘌呤核苷酸前体在培养基中积累；诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前体形成嘌呤核苷酸并在培养基中积累；从培养基中回收所述的嘌呤核苷酸。(2)根据上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是5’-黄苷酸，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黄苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。(3)根据上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是鸟苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的ＤＮＡ，所述ＤＮＡ可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；使所述嘌呤核苷酸前体在培养基中积累；诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前体形成嘌呤核苷酸并在所述培养基中积累；从培养基中回收所述嘌呤核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：高野裕，池田正人，藤尾达郎，
申请(专利权)人：协和发酵工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]