来自具有酶活性的微生物的球形颗粒,其制备方法及应用技术

一种在具有酯酶活性和Ｄ－氨基酸氧化酶活性和／或具有酯酶活性和戊二酰酰化酶活性的混合物中，通过用苯基甲磺酰氟处理，在保存Ｄ－氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性的同时降低酯酶活性的方法；用含伯胺或仲胺的聚合物、可与水形成两相系统的有机溶剂和双功能剂处理具有酶活性的微生物细胞可获得球形颗粒形态的固定化生物催化剂；所述方法和生物催化剂在７－氨基头孢烷酸、７－氨基－３－羟甲基－３－头孢烯－４－羧酸及头孢菌素类抗生素的生产中的应用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抑制酶制剂中的酯酶活性的方法，例如用于酶催化生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的酶制剂；还涉及酶制剂的生产方法，例如用于生产7-ACA和/或7-氨基-3-羟甲基-3-头孢烯-4-羧酸的酶制剂。7-ACA是生产(例如制药)活性头孢菌素类抗生素的关键中间体，例如将7-ACA环系的7位氨基酰化，如用已知在头孢菌素类抗生素的生产中有价值的或在生产这些抗生素的中间体中有价值的基团酰化；例如获得在环系3位有乙酰氧甲基的7-酰化氨基头孢菌素，如头孢噻肟、头孢泊肟(头孢泊肟酯)、头孢来星；及用于生产可衍生自7-ACA的其它头孢菌素类抗生素或其中间体；例如进一步将环系3位的乙酰氧甲基反应获得3位以不同于乙酰氧甲基的基团取代的头孢菌素；例如用已知在生产头孢菌素类抗生素中有价值或已知作为其中间体有价值的基团取代；例如通过乙酰氧基团的亲核取代，或通过将乙酰氧甲基脱乙酰化获得羟甲基(如HACA)，及例如将所得环系3位羟甲基进一步反应，如通过羟基的亲核取代；或去除羟甲基的羟基功能团或去除环系3位的羟甲基；及需要时，将环系4位的羧基酯化，例如用已知在头孢菌素类抗生素的生产中有价值或已知在其中间体中有价值的基团酯化；及需要时通过反应(如按常规方法)获得头孢菌素化合物的盐和/或溶剂化形式。7-ACA和HACA例如可通过环系7位氨基的脱酰化和环系3位乙酰氧甲基的脱乙酰化(例如酶催化)分别从头孢菌素C获得。头孢菌素C酶法脱酰化中有用的酶是例如D-氨基酸氧化酶(DAO)，它催化头孢菌素C的氧化脱胺化，经中间体α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(KA-7-ACA)形成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Gl-7-ACA)。可将Gl-7-ACA水解，获得戊二酸和7-ACA，例如通过戊二酰酰化酶(GAC)水解。已知含DAO和GAC的酶制剂如微生物细胞可能含有其他酯酶活性。可能发生头孢菌素环结构3位侧链的不希望的脱乙酰化，这例如是由于在酶催化的头孢菌素C脱酰化中存在酯酶活性，可形成如头孢菌素C的3-羟甲基衍生物和Gl-7-ACA。这可能造成7-ACA质量和产率的显著下降。通过丙酮或CuSO4处理在DAO存在下降低酯酶活性的常规方法可不完全地降低酯酶活性。现出人意外地发现，用苯基甲磺酰氟(PMSF)处理存在DAO活性的有酯酶活性的混合物或存在GAC活性的有酯酶活性的混合物可显著地(如基本上完全)降低酯酶活性，而可分别保留高DAO或GAC活性，如基本上没有变化。这一发现是令人惊异的，因为按照本专利技术，PMSF(已知通过丝氨酸磺酰化作为含丝氨酸蛋白的不可逆抑制剂)可在DAO活性存在下或在GAC活性存在下选择性地降低存在的酯酶活性，而不显著影响DAO或GAC活性；更令人惊异的是，在GAC活性存在下PMSF对存在的酯酶活性具有选择性和有效的抑制作用，因为酰化酶和酯酶有相似的功能和结构。一方面，本专利技术提供一种在具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰酰化酶活性的混合物中，例如以微生物细胞的形式或以其无细胞提取物形式存在，在保存D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性的情况下降低(如基本上去除)存在的酯酶活性的方法，包括用苯基甲磺酰基氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰酰化酶活性的混合物，其中D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性保留，如用苯基甲磺酰氟处理后与所述处理前的活性基本相同。典型地，D-氨基酸氧化酶活性保留原始值的91％以上，戊二酰酰化酶的活性甚至保留原始值的97％以上。本专利技术的方法例如可按如下进行已知的和有商品供应的产DAO活性的微生物包括如三角酵母属(Trigonopsis)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)，优选三角酵母(Trigonopsis variabilis)微生物。已知的和有商品供应的产GAC活性的微生物包括如假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或转化子，如大肠杆菌转化子，如按常规方法转化的转化子。具有DAO活性或GAC活性和酯酶活性的混合物可通过商业途径获得或按常规方法获得，并可呈无细胞提取物形式，如固定化形式，或呈微生物细胞形式，如部分纯化或未纯化细胞，和/或通透化或未通透化细胞，和/或部分破碎或完整的细胞，和/或固定化或未固定化细胞；如按常规方法可从发酵液中获得的，优选呈无细胞提取物形式，如固定化形式。可从发酵液收获分离微生物细胞并原样使用，如离心发酵液后的湿料形式，或在从发酵液分离之前或之后将细胞按常规方法进一步处理，如将细胞匀浆以获得(如部分)破坏的细胞，和/或将细胞或其碎片通透化以获得通透化细胞或细胞碎片，和/或将细胞或其碎片纯化以获得(如部分)纯化的细胞和/或细胞碎片和/或无细胞(通过絮凝作用)提取物，和/或将细胞或无细胞提取物固定化以获得固定化细胞和/或固定化细胞碎片和/或固定化无细胞提取物。固定化可按常规方法进行；如在丙烯酸(固定化)珠如EupergitR存在下或在离子交换树脂如Relite DianionR存在下按本文实施例中描述的方法进行；或按以下描述的本专利技术另一方面的方法进行。微生物细胞可以以如经过缓冲的细胞水悬液的形式使用，将从发酵液中分离的细胞重新悬浮于水或缓冲液中即可得到该悬液，或如果是无细胞提取物，可使用无细胞提取物水溶液。悬液或溶液的pH值应大约为中性，例如pH值6.5-8.5，如7.0或7.0左右比较合适。本专利技术优选的具有酯酶活性和DAO活性的混合物应例如基本上没有例如天然过氧化氢酶活性，例如可将具有DAO、酯酶和过氧化氢酶活性的细胞水性混合物在碱性介质(例如pH值9-11.5，如10-11)中处理，例如加入苛性钠溶液，即可得到基本没有天然过氧化氢酶活性的混合物。对具有酯酶活性和DAO活性的混合物或具有酯酶活性和GAC活性的混合物用PMSF进行处理，例如在加入适当浓度范围(例如0.5％-2.5％，如1％-10％)的PMSF溶液后在适当的温度下(如室温)保温适当的时间(例如几小时，如1-5小时，如2.5-4小时或更长时间)，用适当溶剂(例如醇，如(C1-C4)的链烷醇如乙醇制成PMSF溶液。每100升细胞悬液中加入总量例如1000毫升的PMSF溶液(例如以上所述之浓度范围的PMSF溶液)，实际上可能足以完全且不可逆地去除不需要的酯酶活性，并例如基本上不降低起始混合物中存在的DAO或GAC活性。在相似的反应条件下，比较在从头孢菌素C制备Gl-7-ACA或7-ACA的反应中使用经PMSF处理的具有DAO或GAC活性的混合物和使用未经PMSF处理的具有DAO或GAC活性的混合物所得到的脱乙酰化产物的量，即可测定酯酶活性的去除。可得到DAO或GAC活性很高的混合物，例如基本上与用PMSF处理前相同，而同时酯酶活性例如基本上完全去除。可根据本专利技术得到的混合物可用于如从头孢菌素C生产7-ACA。在相同反应条件下，使用经PMSF处理的DAO和/或GAC活性与使用未经PMSF处理的DAO和/或GAC活性相比较，得到的7-ACA的产率和纯度得到提高。因此，例如根据本专利技术的酯酶活性去除作用可导致减少，例如基本上不产生，在DAO和/或GAC反应中由于酯酶活性而产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在具有酯酶活性和Ｄ－氨基酸氧化酶和／或戊二酰酰化酶活性的混合物中，在保存Ｄ－氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性的情况下，降低酯酶活性的方法，包括用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和Ｄ－氨基酸氧化酶活性和／或戊二酰酰化酶活性的混合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A雷克特，W里索斯特，F克诺斯德，N帕尔马，
申请(专利权)人：生物化学有限公司，
类型：发明
国别省市：AT[奥地利]