Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了Lnc03729基因作为生物标志物可用于制备肺腺癌的诊断、预后评估及治疗指导标志物等。本发明专利技术从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量PCR技术检测其中Lnc03729的表达，并外源性上调人肺腺癌细胞Lnc03729的表达，MTS及Transwell实验检测细胞增殖转移能力的变化情况。结果显示Lnc03729在肺腺癌组织中低表达，上调人肺腺癌细胞Lnc03729的表达后，细胞增殖转移能力均显著下调，提示Lnc03729可作为肺腺癌细胞恶性程度及患者预后评估的标志物。本发明专利技术为肺腺癌的辅助诊断、预后预测及治疗指导提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Application of Lnc03729 gene as a biomarker in prediagnostic reagents for lung adenocarcinoma

The invention discloses the Lnc03729 gene as a biomarker for the preparation of lung adenocarcinoma, the evaluation of prognosis and the marker of treatment guidance. The present invention from the extraction of lung adenocarcinoma and normal lung tissue samples in RNA after reverse transcription, expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Lnc03729 Lnc03729, and exogenous upregulation of human lung adenocarcinoma cell line expression, changes of cell proliferation was detected by MTS and Transwell experimental metastasis. The results showed that the expression of Lnc03729 was low in lung adenocarcinoma tissues, up regulating the expression of Lnc03729 in human lung adenocarcinoma cells, and the ability of cell proliferation and metastasis was significantly down regulated, suggesting that Lnc03729 can be used as a marker of malignancy and prognosis in lung adenocarcinoma cells. The invention provides a powerful molecular biological tool for auxiliary diagnosis, prognosis prediction and treatment guidance of lung adenocarcinoma, and has far-reaching clinical significance and important application prospect.

【技术实现步骤摘要】
Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用
本专利技术属于生物
，涉及Lnc03729基因在制备肺癌诊断、预后评估及治疗指导的应用，具体涉及Lnc03729作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。
技术介绍
肺癌是全球范围最常见、死亡率最高的恶性肿瘤，我国肺癌形势同样相当严峻，2015年我国肺癌新发73.33万例，死亡61.02万例，是我国第一大恶性肿瘤。肺癌根据组织学类型可分为小细胞肺癌（SCLC）及非小细胞肺癌（NSCLC），后者可细分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌，其中肺腺癌占所有肺癌的50%以上，是主要的病理类型。多数肺腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌，故患者早期多无明显的临床症状，但部分患者可出现早期的血行转移，且绝大多数患者在确诊时已属相对晚期，导致患者失去根治性手术的机会。因此，早期诊断和及早治疗对肺腺癌者的疗效与预后至关重要。LncRNA长度超过200nt的非编码RNA（ncRNA），其不参与蛋白质的翻译，却可通过多种表观遗传调控机制发挥生物学作用，包括染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控及RNA降解等，基于LncRNA广泛的生物学作用，其与恶性肿瘤的关系也逐步被人们所发现，多种长链非编码RNA被发现参与调控恶性肿瘤的发生发展：HOTAIR基因在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝细胞癌及脑胶质瘤中表达明显上调，且可通过介导H3K27甲基化、上调HOXD10及PCDH等原癌基因的表达促进相关肿瘤细胞的增殖转移、及血管生成的能力；H19基因在肺癌、食管癌及前列腺癌组织中高表达，并可介导细胞EMT进程促进细胞侵袭转移；MALAT-1在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌组织中高表达，其可作为肝细胞癌复发的独立危险因素，具有潜在的促癌作用；MEG3则在多种恶性肿瘤中表达下调，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌及卵巢癌等，其在体内外可与P53基因相互作用，抑制细胞增殖能力，促进细胞凋亡，并可上调细胞化疗药物敏感性；另外LSINCT5、HULC、GAS5等LncRNA均与恶性肿瘤发生发展存在密切关系。我们的研究发现Lnc03729在肺腺癌中表达显著下调，且尚未有关于Lnc03729与恶性肿瘤关系的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供Lnc03729基因在肺腺癌诊断、预后评估及治疗指导方面的应用。专利技术人研究发现，Lnc03729在肺腺癌中低表达，且在体外可抑制肺腺癌细胞增殖及侵袭迁移的能力，是潜在的抑癌基因。因此，Lnc03729基因可成为肺腺癌诊断、预后评估及治疗指导的新标志物。通过本专利技术专利技术人的研究表明，Lnc03729基因可作为生物标志物用于制备肺腺癌的预诊断试剂和试剂盒，制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物等。本专利技术还提供了检测肺腺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有如下引物对：用于实时荧光定量检测Lnc03729基因表达的引物对：正向引物：5’-TTGGTGGATGCTGACCTTCA-3’（SEQIDNO.1）；反向引物：5’-ACCAGAAACCAGATGTAGCCA-3’（SEQIDNO.2）；内参基因β-Actin特异性PCR引物对：正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’（SEQIDNO.3）；反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’（SEQIDNO.4）。所述试剂盒中还包括：从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂；以总RNA为模版将Lnc03729逆转录为cDNA的试剂；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂。所述从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂包括RNAisoPlus、三氯甲烷、异丙醇、体积百分比浓度为75%的乙醇、无核酶水；以总RNA为模版将Lnc03729逆转录为cDNA的试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂包括实时荧光定量SYBRGreen染料、无核酶水。总之，本专利技术从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测Lnc03729的表达，结果显示Lnc03729在肺腺癌组织中低表达，提示Lnc03729可成为肺腺癌的预诊断分子标志物，进而指导临床工作的开展。附图说明图1为实时荧光定量PCR技术检测Lnc03729在肺腺癌及癌旁组织中的表达情况，结果显示肺腺癌中Lnc03729的表达相比正常肺组织中显著下降；图2为在肺腺癌细胞H358及A549中转染Lnc03729全长表达载体，使H358及A549细胞Lnc03729外源性过表达；图3为过表达H358及A549细胞Lnc03729后，细胞增殖能力显著下降；图4为过表达H358及A549细胞Lnc03729后，细胞侵袭迁移能力显著下降。具体实施方式实施例1实时荧光定量PCR法检测Lnc03729在肺腺癌中的低表达：1.材料与方法1.1材料RNA提取试剂Trizol（#9109，Takara）；逆转录试剂盒（#A3500，Promega）；SYBR®PremixExTaq™荧光染料（#RR420A，Takara）；无核酶水（#10977023，Invitrogen）。1.2方法收集24对肺腺癌及癌旁组织，抽提总RNA，取1μg行逆转录得到cDNA模板，实时荧光定量PCR技术检测两种组织中Lnc03729表达水平。Lnc03729基因正向引物：5’-TTGGTGGATGCTGACCTTCA-3’；反向引物：5’-ACCAGAAACCAGATGTAGCCA-3’；内参基因β-Actin正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。实时荧光定量PCR反应体系如下：SYBR®PremixExTaq™（2×）10μL、PCRPrimer(1μM)5μl、cDNA模板(1μg/ml)5μl，总体积20μl实时荧光定量PCR反应步骤：(1)94℃5min(2)95℃10sec(3)58℃30sec(4)72℃20sec(5)Plateread(6)82℃30sec(7)Plateread(8)Gotostep2formore39times(9)Performmeltingcurvefrom55.0℃to95.0℃,readevery0.2℃,holdfor1sec反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(thresholdcyclevalues)、内参基因(β-Actin)标化后，采用groupt-test检验计算P值。2.结果肺腺癌组织中Lnc03729表达水平显著低于癌旁组织，见图1。实施例2构建稳定过表达Lnc03729的H358及A549肺腺癌细胞系：1.材料与方法1.1材料人肺腺癌细胞H358、A549及人胚肾细胞293T（ATCC）；DMEM培养基、1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清及胰蛋白酶（Gibco）过表达Lnc03729载体（山东维真生物）；慢病毒包装载体Gag-Pol、REV、VSV-G（addgene）；EcoliDH5α感受态细胞（#D9057，Takara）；质粒抽提试剂盒（#D6943-本文档来自技高网...

【技术保护点】
Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。2.Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂盒中的应用。3.Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预后评估试剂或治疗药物中的应用。4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述Lnc03729基因包括RNA。5.检测肺腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：用于实时荧光定量检测Lnc03729基因表达的引物对：正向引物：5’-TTGGTGGATGCTGACCTTCA-3’；反向引物：5’-ACCAGAAACCAGATGTAGCCA-3’；内参基因β-Actin特异性PCR引物对：正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶永光，杨瑞，
申请(专利权)人：中南大学，杨瑞，
类型：发明
国别省市：湖南,43