本发明专利技术提供显示衣壳性能改变的突变的腺伴随病毒（ＡＡＶ），所述性能改变例如是与血清中和抗体的结合能力降低和／或与肝素的结合能力改变和／或对特定细胞类型的感染力改变。本发明专利技术还提供在衣壳基因中含有一个或多个突变的突变型ＡＡＶ的文库。本发明专利技术还提供产生突变型ＡＡＶ、突变型ＡＡＶ文库的方法，以及含有突变型ＡＡＶ的组合物。本发明专利技术还提供含有突变体衣壳蛋白的重组ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）病毒粒子。本发明专利技术还提供含有编码突变体衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸，以及含有该核酸的宿主细胞。本发明专利技术还提供将基因产物递送至个体的方法，所述方法通常包括将有效量的所述ｒＡＡＶ病毒粒子施用至需要它的个体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组腺伴随病毒载体领域。
技术介绍
腺伴随病毒(AAV)是一种含有两个开放读框(rep和cap)的4.7Kb、单链DNA病毒。第一个基因编码基因组复制所需的4种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，第二个基因表达装配形成病毒衣壳的3种结构蛋白(VP1-3)。如其名字所示，AAV的活性复制依赖辅助病毒，例如腺病毒或疱疹病毒的存在。无辅助病毒时，AAV呈潜伏状态，其基因组维持为游离体形式或整合进宿主染色体。虽然AAV2的特征了解最清楚的是可作为基因递送载体，但迄今已鉴定了8种同源性灵长类AAV血清型和许多非人灵长类的类型。1989年首次制造了重组AAV2(rAAV)基因递送系统，然后基于AAV的载体显示出能提供许多主要优点。首先，既然野生型AAV是非致病性与任何已知的疾病在病原学上无关，基于AAV的载体极其安全。此外，AAV能高效递送基因并且在许多组织中可维持转基因的表达，包括肌肉、肺和脑。另外，AAV在人类临床试验中获得成功。尽管在这方面取得成功，载体的设计依然存在问题。主要问题是多数人群已接触过各种AAV血清型，结果是将来的任何患者群中相对大的一部分人存在有阻断其基因递送的中和抗体(NAB)。rAAV载体的其它问题包括利用硫酸肝素作为受体的血清型(AAV2和3)的组织分散能力有限，对非感染性(non-permissive)类型细胞(例如，干细胞)的感染能力差，难以高效地使基因靶向递送选择的细胞群以及转基因携带能力有限。技术上需要改进AAV载体以避免被抗AAV的血清抗体所中和。本专利技术满足了这种需要。参考文献Halbert等.，(2000)J Virol 74，1524-32；Blacklow等.，(1971)Am J Epidemiol94，359-66.(1971)；Erles等.，(1999)J Med Virol 59，406-11；Moskalenko等.，(2000)J Virol 74，1761-6；Wobus等.，(2000)J Virol 74，9281-93；Sun等.，(2003)Gene Ther 10，964-76；Nguyen(2001)Neuroreport 12，1961-4；Davidson等.，(2000)Proc Natl Acad Sci美国97，3428-32；Rabinowitz等.，(1999)Virology265，274-85；Opie等.，(2003)J Virol 77，6995-7006；美国专利号6,596,539；美国专利号6,733,757；美国专利号6,710,036；美国专利号6,703,237。专利技术概述本专利技术提供显示衣壳性能改变的突变的腺伴随病毒(AAV)，例如与血清中和抗体的结合能力降低和/或肝素结合能力改变和/或对特定细胞类型的感染力改变的AAV。本专利技术还提供了在衣壳基因中含有一种或多种突变的突变型AAV文库。本专利技术还提供生产突变型AAV和突变型AAV文库的方法，以及含有突变型AAV的组合物。本专利技术还提供含有突变的衣壳蛋白的重组AAV(rAAV)病毒粒子。本专利技术还提供含有编码突变的衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸和含有该核酸的宿主细胞。本专利技术还提供递送基因产物至个体的方法，该方法通常涉及向需要它的个体施用有效量的所述rAAV病毒粒子。附图简述附图说明图1a和1b显示了野生型AAV和所述病毒文库的肝素结合性能。图2a和2b显示了抗体中和逃逸突变体的产生。图2a描述了在各种严谨性(按中和抗体滴度(稀释度的倒数)与实际稀释度之比给出)时所拯救的组分(按照0严谨性时标准化)。图2b描述了兔抗血清使野生型AAV、AAV文库和各AAV逃逸突变体的感染力降低(减少)的百分率。图3A-C描述了野生型AAV cap(SEQ ID NO1)的核苷酸序列与中和抗体逃逸突变体AbE2(SEQ ID NO2)和AbE L(SEQ ID NO3)的cap的核苷酸序列的对比情况。方框表明与野生型相比核苷酸序列中的改变。图4A-G描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码核苷酸序列(SEQ ID NO4)与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。图5A-C描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码的氨基酸序列(SEQ ID NO5)与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。图6A-J描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码核苷酸序列与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。图7A-D描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码的氨基酸序列与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。图8A-G描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码核苷酸序列与示范性肝素结合突变体的对比情况。图9A-C描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码的氨基酸序列与示范性肝素结合突变体的对比情况。定义文中使用的术语“载体”指含有多肽或与多肽结合并可用于介导多肽递送至细胞的大分子或大分子的联合体。说明性的载体包括，例如质粒、病毒载体、脂质体或其它基因递送载体。“AAV”是腺伴随病毒的缩写并可用于指病毒自身或其衍生物。除了需要指出的地方，该术语包括所有的亚型和天然存在的和重组形式的AAV。缩写“rAAV”指重组腺伴随病毒，也指重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV。“灵长类AAV”指能感染灵长类的AAV，“非-灵长类AAV”指能感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指能感染牛等哺乳动物的AAV。文中使用的“rAAV载体”指含有非AAV起源(即，对AAV而言是异源性多核苷酸)的多核苷酸序列的AAV载体，通常是用于遗传性转化细胞的感兴趣的序列。总体上，异源多核苷酸的两侧连接有至少一条，一般是两条AAV末端反向重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指至少含有一种AAV衣壳蛋白(通常是野生型AAV的全部衣壳蛋白)和一种包裹的多核苷酸的rAAV载体的病毒颗粒。如果该颗粒含有异源性多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，一般称为“rAAV载体颗粒”或简单地称为“rAAV载体”。由于这种载体包含于rAAV颗粒中，产生rAAV颗粒需要包括产生rAAV载体。“包装”指导致AAV颗粒装配和包裹的一系列胞内过程。AAV“rep”和“cap”基因指编码腺伴随病毒的复制和包裹蛋白的多核苷酸序列。文中AAV rep和cap指AAV“包装基因”。AAV的“辅助病毒”指能使AAV(例如，野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。各种这样的AAV辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。虽然C亚群的5型腺病毒是最常用的，但腺病毒还包括许多不同的亚群。已知许多人、非人哺乳动物和鸟源的腺病毒并可得自保藏机构，例如A本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有编码突变型腺伴随病毒（ＡＡＶ）衣壳蛋白的核苷酸序列的分离的核酸，其中，相比于野生型ＡＡＶ衣壳蛋白，所述突变型ＡＡＶ衣壳蛋白含有至少一个氨基酸取代。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：DV谢弗，B卡斯帕，N马赫什里，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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