GeXP多重PCR鉴别鹿种的组合物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分的GeXP多重PCR方法。本发明专利技术还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物。本发明专利技术还涉及包含所述组合物的GeXP多重PCR试剂盒。使用本发明专利技术的组合物进行GeXP多重PCR检测，能够通过一次检测，简单、快速、特异且灵敏地检测多种鹿种成分。

GeXP multiple PCR compositions, kits and methods for identifying deer species

The invention relates to a method for multiple GeXP PCR red deer, reindeer, deer, fallow deer, white lipped deer 5 deer species composition. The invention also relates to a oligonucleotide primer probe composition for the method described. The invention also relates to a GeXP multiple PCR kit containing the composition. Using the composition of the present invention to detect GeXP multiple PCR, it can be detected by one time, and it is simple, fast, specific and sensitive to detect a variety of deer species.

【技术实现步骤摘要】
GeXP多重PCR鉴别鹿种的组合物、试剂盒和方法
本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于定性检测多种鹿种成分的GeXP多重PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。
技术介绍
鹿类动物及其产品自古被认为食用保健之上等品。2000年，梅花鹿和马鹿被列入《中华人民共和国药典》正品药材，此后鹿类动物及其产品在食品药品保健品中的应用逐渐增多，如鹿茸、鹿角、鹿角胶等。鹿肉也是肉品中的高端产品，具有较高的营养价值。因此，鹿成分掺假成为重要的食品检验项目。目前，国内外进行物种鉴定的方法主要有：一是以传统形态学检测方法和显微、光谱、色谱、传感器、质谱技术等为代表的理化鉴别方法；二是生物学鉴定方法，如蛋白质免疫电泳、免疫凝集技术，和基于药理学的生物药效评价法；但这两种方法易受产品状态影响，如成熟度不同成分复杂难辨、外观性状相似混淆不清、加工程度大致使理化性质改变等而失去准确性。目前基于分子生物学的现代分子检测技术发展迅速，如PCR或实时荧光PCR技术，但受到通量的限制，一次只能检测一种鹿种，而普通的多重PCR技术一方面分辨率不足，另一方面存在严重的扩增偏好性，而且传统的电泳技术操作繁琐，重现性较低。GeXP技术是多重PCR领域的突破性技术，该技术将毛细管电泳分离技术和高灵敏的激光诱导技术相结合，采用特异性嵌合引物在同一反应体系而引发目的基因扩增的技术，其中嵌合引物包含了基因特异性引物序列，从而保持反应体系中各模板DNA的比例在扩增过程中不变，克服了多重扩增偏爱性的问题，同时实现多重PCR产物检测目的。该技术可对多个基因进行系统、全面、准确的检测与鉴定，且操作快速、简单，具有很高的特异性和灵敏度，适用于多个基因的同时检测，克服单重通量不高的局限性外可大大提高检测效率，同时避免多重扩增偏爱性，降低检测成本、缩短检测周期，具有显著的经济与社会效益等。
技术实现思路
本申请提供了马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿种成分GeXP多重PCR检测方法，以鹿种线粒体D-loop，cytb基因为目标，在各鹿种相互特异的基因区段分别设计驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿的特异性引物，筛选得到的特异性检测引物，同时从文献筛选到一对马鹿特异性引物，通过GeXP多重基因表达分析系统分析平台进行检测，依据产物片段大小和峰值来确定靶基因，有助于提高检测特异性；系统使用的毛细管电泳和荧光标记目的片段则可以提高分辨率和灵敏度；根据片段大小可同时检测相差至少5bp以上的多个靶基因。该技术解决了其他技术存在的通量受限、扩增偏好性等问题。在本专利技术的一个方面，提供了驯鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游驯鹿-F（5’-GTAGGCATGAGCATGGCAGT-3’）和驯鹿-R（5’-AAGATTGTGGGGTTGAACCGT-3’）。该引物可特异性识别驯鹿的D-loop序列，扩增片段长度70bp。在本专利技术的一个方面，还提供了麋鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游麋鹿-F（5’-AAAATCAAGAACTTTATCAG-3’）和麋鹿-R（5’-CATTATGTGTCTTGTTGTATAGC-3’）。该引物可特异性识别麋鹿的D-loop序列，扩增片段长度120bp。在本专利技术的一个方面，还提供了黇鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游黇鹿-F（5’-AAAATCAAGAACTTTATCAG-3’）和黇鹿-R（5’-AAGCGTAGGGTTGTATCACA-3’）。该引物可特异性识别黇鹿的D-loop序列，扩增片段长度130bp。在本专利技术的一个方面，还提供了白唇鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游白唇鹿-F（5’-CATCGCAGCACTTGCCATAG-3’）和白唇鹿-R（5’-GAAGAGTACCAGAAGTAGGATGCC-3’）。该引物可特异性识别白唇鹿的cytb序列，扩增片段长度150bp。以上5组引物最适反应条件：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。扩增产物以2%琼脂糖电泳检测，以分子凝胶成像系统观察结果。在本专利技术的另一个方面，提供了GeXP多重PCR检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿种成分的特异性嵌合引物。这5对特异性嵌合引物则分别是在原有特异性引物的基础上，将上游引物的5’端连接上通用标签AGGTGACACTATAGAATA，将下游引物的5’端连接上通用标签GTACGACTCACTATAGGGA，该标签使得5种鹿种扩增片段长度增长37bp。GeXP多重PCR反应条件：95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；4℃保存。扩增产物用GeXP多重分析表达仪进行片段分析。在本专利技术的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。在本专利技术的另一个方面，提供了用于4种鹿成分单重PCR、5种鹿成分多重PCR及GeXP多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。本专利技术提供的试剂盒包括本专利技术的用于单重PCR、多重PCR及GeXP多重PCR检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿特异性引物和使用说明书。在一个实施方案中，本专利技术的马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿特异性引物分别根据基因鹿种线粒体D-loop，cytb基因序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含驯鹿特异性扩增靶序列为:GTAGGCATGAGCATGGCAGTCAATGGTAGCAGGACATAATTATTATTTCACGGTTCAACCCCACAATCTT(SEQNo.1)。麋鹿特异性扩增靶序列为:AAAATCAAGAACTTTATCAGTATTAAATTTCCAAAAATTTTAATAATTTAATACAGCTTTCTACTCAACACCCAATTTACATTTTTATATACCACTAGCTATACAACAAGACACATAATG(SEQNo.2)。黇鹿特异性扩增靶序列为:AAAATCAAGAACTTTATCAGTATTAAATTTTTAAAAATTTCTAATAATTTAATACAGCTTTCCACTCAACATCCAATTTACATTTTATATCCATTAATTACACAGCAAAACATGTGATACAACCCTACGCTT(SEQNo.3)。白唇鹿特异性扩增靶序列为:CATCGCAGCACTTGCCATAGTACACTTACTCTTCCTTCACGAGACAGGATCCAATAACCCAACAGGAATCCCATCAAACGCAGACAAAATCCCCTTCCATCCTTACTACACCATTAAAGATATCTTAGGCATCCTACTTCTGGTACTCTTC(SEQNo.4)。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重PCR、多重PCR及GeXP多重PCR检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本专利技术的用于检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。在一个实施方案中，所述GeXP多重PCR检测方法对5种鹿成分的最低检测DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过GeXP多重PCR检测方法检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿这5种成分的组合物，所述组合物包含马鹿引物序列SEQ ID No. 1，驯鹿引物序列SEQ ID No.2，麋鹿引物序列SEQ ID No. 3，黇鹿引物序列SEQ ID No. 4，白唇鹿引物序列SEQ ID No. 5。

【技术特征摘要】
1.通过GeXP多重PCR检测方法检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿这5种成分的组合物，所述组合物包含马鹿引物序列SEQIDNo.1，驯鹿引物序列SEQIDNo.2，麋鹿引物序列SEQIDNo.3，黇鹿引物序列SEQIDNo.4，白唇鹿引物序列SEQIDNo.5。2.根据权利要求1所述的组合物，其中特异性嵌合引物则分别是在权利要求1所述的组合物的基础上，将上游引物的5’端连接上通用标签AGGTGACACTATAGAATA，将下游引物的5’端连接上通用标签GTACGACTCACTATAGGGA。3.用于基于GeXP多重PCR检测方法鉴别马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿成分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的组合物。4.根据权利要求4所述的方法，包括步骤：a）获得来自待测鹿产品的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，吴亚君，凌胜男，杨艳歌，刘鸣畅，韩建勋，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11