一种Ty‑3分子标记的引物ACY及其标引方法技术

本发明专利技术涉及一种Ty‑3分子标记的引物ACY及其标引方法，对番茄黄化曲叶病毒病抗感两种材料的番茄叶片基因组DNA进行PCR扩增，获得了区分抗病品种与感病品种准确高效的分子标记，标记稳定可靠，有利于番茄分子标记辅助选择育种，本发明专利技术设计的Ty‑3特异性分子标记引物，在抗病品种中扩增出132bp，感病品种中扩增出123bp的条带，条带清晰，且由于是在基因区内设计的引物，所以不会发生因交换而产生的假阳性，保证了鉴定结果的准确可靠性，其鉴定结果与所用材料的田间表型完全一致。

Primer ACY a Ty 3 molecular markers and indexing method

The invention relates to a primer ACY Ty 3 molecular markers and indexing method, genomic DNA of tomato leaves of two kinds of materials of resistant and susceptible tomato yellow leaf curl virus was amplified by PCR, the molecular marker to distinguish between resistant varieties and susceptible varieties of accurate and efficient, stable and reliable marker assisted selection, breeding for tomato molecular mark, the invention designs Ty 3 specific molecular marker primers, 132bp was amplified in resistant varieties, are amplified bands of 123bp cultivars, bands were clear, and because the primers designed in gene region, so it will not happen due to false positive exchange, ensure the accuracy and reliability of the identification results, the identification results are completely consistent with the phenotype of materials.

【技术实现步骤摘要】
一种Ty-3分子标记的引物ACY及其标引方法
本专利技术涉及一种Ty-3分子标记的引物ACY及其标引方法，属于生物工程

技术介绍
番茄黄化曲叶病毒病（tomatoyellowleafcurldisease，TYLCD）是由双生病毒科番茄黄化曲叶病毒（tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）引起的一种在番茄（S.lycopersicum）生产上极具毁灭性的病害。20世纪30年代后期，在以色列首次报道了TYLCD，20世纪60年代，该病害在地中海盆地番茄上大爆发（Antignusetal.1994），随后蔓延到非洲，欧洲，亚洲，加勒比海和北美等地，该病害的发生在番茄中常造成巨大的产量损失，甚至高达100％（Antignusetal.1994;Picoetal.1996;Czosneketal.1997;Polstonetal.1997;Delatteetal.2005）。1998年于广西南宁首次发现中国番茄黄化曲叶病（刘玉乐等,1998），随后TYLCD在中国不同的番茄种植区也有发生。长久以来，通过对白粉虱群体数量的控制来防治TYLCD，但由于白粉虱繁殖和传播能力非常强，传统的物理化学防治措施效果并不理想，而且化学试剂的使用虽可减少番茄的部分产量损失，但其易造成白粉虱抗药性以及环境污染的加剧（Cahilletal.1996a,1996b;ElbertandNauen2000;Picóetal.1996;McCauleyetal.2006;Chowdhuryetal.2013）。因此，解决该病害最为经济有效环保的措施是培育抗病品种，从根本上防治番茄黄化曲叶病毒病。迄今为止，已经鉴定出的来自野生番茄中的抗Ty基因有：Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a，Ty-4和Ty-6，特别是来自智利番茄的Ty-1被认为是番茄抗病育种的主抗病基因源，随后被证明其与Ty-3是等位基因（Verlaanetal.2011,2013）。随着分子生物学的发展，分子标记被广泛用于番茄的标记辅助选择育种，包括CAPS，SNP和SCAR标记，已经设计了许多Ty-1/Ty-3相关的分子标记。然而，大多数分子标记与抗性基因之间有一定距离，在标记过程中会出现因连锁标记与抗病基因交换而产生的假阳性（Jietal.,2007，2012）。此外，有些标记如CAPS标记，在实际应用中需要经过PCR扩增和用限制性内切酶酶切扩增产物这两个漫长的步骤，这使得它们的基因分型耗时长，且成本昂贵。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供本专利技术提供了一个稳定准确高效的Ty-3基因特异性的功能标记引物ACY。该标记引物ACY可避免在实际应用中出现因交换而产生的假阳性，使检测结果更加准确可靠，在番茄抗Ty育种中可以广泛应用，能够更有效防止黄化曲叶病毒病发生。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3分子标记的引物ACY，所述番茄Ty-3抗性基因特异性标记引物序列为：正向引物序列为F：5'-CCTTATGATGTCTCGTGAAAGG-3'反向引物序列为R：5'-GAAGCACAGATTGAAGAAAACC-3'。进一步地，所述标记引物ACY对抗病品种扩增出132bp的片段大小，分子标记对感病品种扩增出123bp片段。一种标记番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3的方法，采用上述引物ACY对目标材料的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若能扩增出132bp的扩增片段，则表明该杂交后代含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3，否则则表面不含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3。进一步地，所述PCR扩增反应体系为25μL，包括12.5μL2×TaqMasterMix，1μLDNA提取物，10μM的正反向引物各1μL，9.5μLddH2O，反应程序为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。进一步地，所述扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现扩增的DNA条带。进一步地，还包括通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测目标材料DNA的质量与浓度。分子标记的引物ACY在筛选抗黄化曲叶病毒病番茄品种中的应用，通过引物ACY,可以稳定可靠地筛选出抗黄化曲叶病毒病番茄品种，防止灾害发生。本专利技术的有益效果是，对番茄黄化曲叶病毒病抗感两种材料的番茄叶片基因组DNA进行PCR扩增，获得了区分抗病品种与感病品种准确高效的分子标记，标记稳定可靠，有利于番茄分子标记辅助选择育种，本专利技术设计的Ty-3特异性分子标记引物，在抗病品种中扩增出132bp，感病品种中扩增出123bp的条带，条带清晰，且由于是在基因区内设计的引物，所以不会发生因交换而产生的假阳性，保证了鉴定结果的准确可靠性，其鉴定结果与所用材料的田间表型完全一致。利用该分子标记辅助选择抗病品种，操作简便，节约时间和成本。通过本专利技术，只需简单提取番茄叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定番茄材料是否抗Ty-3，选择抗病品种。不仅避免了常规育种方法繁琐的筛选过程，更重的是避免了连锁标记在实际应用中出现因交换而产生假阳性，使得抗病性鉴定结果更加准确可靠高效。在扩增之前通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测目标材料DNA的浓度，从而保障用于扩增的DNA质量良好，进一步保障标记结果。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1.新标记ACY引物设计与DNA序列模式图。图2.四个番茄商品品种测序结果。图3.功能标记ACY筛选结果。图4.连锁标记P6-25筛选结果。图5.F2群体在聚丙烯酰胺凝胶中扩增结果。具体实施方式现在结合附图对本专利技术作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本专利技术的基本结构，因此其仅显示与本专利技术有关的构成。实施例一：本实施例根据野生番茄（Solanumpennellii）与栽培番茄（Solanumlycopersicum）基因组序列，在NCBI数据库中利用BLAST工具进行序列比对Ty-3候选基因Solyc06g051170的序列，发现存在单个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基，甚至9个碱基、10个碱基的缺失。根据9个碱基与10个碱基的缺失，用设计引物，用6个抗病商品品种与6个感病商品品种进行PCR扩增，发现据10bp的缺失设计的引物可以很好的区分抗感病品种，且带型明显、清晰，扩增出的抗病品种的条带大小为132bp,而感病品种的片段大小为123bp。预测该InDel标记位于番茄6号染色体，Ty-3候选基因solyc06g051170片段的第4个内含子的位置，如图1中A、B、C所示,A表示番茄6号染色体上标记ACY的初步绘制位置；B表示Ty-3基因位点Solyc06g051170的预测结构（由12个外显子和11个内含子组成），InDel缺失在第4个内含子的位置；C表示野生番茄与栽培番茄基因序列10bp的插入缺失比对。由于该标记扩增出的基因片段大小在130bp左右，为了方便连载体进行测序，我们在该标记的前后各设计了新的引物Seq-F，Seq-R，如图1中D所示,D表示引物设计的模式图，其中X表示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番茄黄化曲叶病抗性基因Ty‑3分子标记的引物ACY，其特征在于，所述番茄Ty‑3抗性基因特异性标记引物序列为：正向引物序列为F：5'‑ CCTTATGATGTCTCGTGAAAGG ‑3'反向引物序列为R：5'‑ GAAGCACAGATTGAAGAAAACC ‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3分子标记的引物ACY，其特征在于，所述番茄Ty-3抗性基因特异性标记引物序列为：正向引物序列为F：5'-CCTTATGATGTCTCGTGAAAGG-3'反向引物序列为R：5'-GAAGCACAGATTGAAGAAAACC-3'。2.根据权利要求1所述的番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3分子标记的引物ACY，其特征在于，所述标记引物ACY对抗病品种扩增出132bp的片段大小，分子标记对感病品种扩增出123bp片段。3.一种标记番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3的方法，其特征在于，采用如权利要求1的引物ACY对目标材料的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若能扩增出132bp的扩增片段，则表明该杂交后代含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3，否则则表面不含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-3。4.根据权利要求3所述的标记番...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿门，卢霞，李永博，张文婷，司龙亭，
申请(专利权)人：江苏绿港现代农业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32