拟菌颗粒佐剂的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种拟菌颗粒佐剂的制备及应用，属于生物疫苗技术领域。选用长型双歧杆菌、枯草芽孢杆菌ＡＰＣＣ９３７２之一的细菌悬液，经洗涤，离心，弃上清，干燥等，制备干燥菌体；再用５％冰醋酸洗涤，离心，弃上清，用１％冰醋酸重悬，离心，弃上清，重复上述过程１次；１％冰醋酸重悬，１００℃孵育，灭菌，离心，弃上清；０．９％ＮａＣｌ及蒸馏水洗涤，离心，弃上清；冻干，制得拟菌颗粒佐剂。用于弱抗原疫苗的制备，如ＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＣＭＶ等，其用于制作乙肝治疗疫苗及预防性疫苗；或者应用于抗肿瘤的后选药物。本发明专利技术的拟菌颗粒佐剂具有强烈刺激体细胞免疫的功能。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种拟菌颗粒佐剂的制备及应用，属于生物疫苗
传统的佐剂存在着各种各样的问题，如所诱导的免疫类型单一(如铝佐剂)、毒性大(如完全福氏佐剂)、进入体内容易被降解、价格昂贵(如细胞因子)等。许多已上市的疫苗，如乙肝亚单位疫苗临床效果并不理想；强效流感佐剂PCPP、MF-59等存在III期临床应用问题等。至目前，尚未发现较理想的、具有应用价值的疫苗佐剂。因此，在疫苗领域亟待探求具有高效增强疫苗抗原性、双相调控免疫应答的方向，又可以减少副作用，减低疫苗制备成本的免疫佐剂，从而从根本上解决疫苗研究所带来的困惑。本专利技术的拟菌颗粒佐剂的制备方法是选用长型双歧杆菌(Bif 60-1)、枯草芽孢杆菌APCC9372之一的细菌悬液，浓度为1010～1013/ml；依此用水、丙酮、乙醚洗涤，然后离心，弃上清，干燥，每升菌液制备干燥菌体约1～1.5克；再用5％冰醋酸洗涤，离心，弃上清，用1％冰醋酸重悬，离心，弃上清，重复上述过程1次；1％冰醋酸重悬，100℃孵育1～2小时，灭菌，无菌条件下离心，弃上清；0.9％NaCL洗涤，蒸馏水洗涤，离心，弃上清；冻干，制得拟菌颗粒佐剂。上述离心条件是2500rpm/min，10～15分钟。上述5％冰醋酸用0.9％NaCl配制。具体操作步骤如下1.所用菌种为长型双歧杆菌(Bif 60-1)、枯草芽孢杆菌APCC9372之一，以细菌的生长特性进行常规培养，收集细菌悬液，浓度为1010～1013/ml；2.用蒸馏水洗2～3次，丙酮洗2～3次，乙醚洗1～2次，时间5～10min，2500rpm/min离心，10～15分钟，弃上清，真空干燥、称重，每升菌液制备干燥菌体约1～1.5克；3.取上述干燥菌体，每克菌体加入5％冰醋酸15～20ml，洗涤、2500rpm/min离心、10～15分钟，弃上清，用1％冰醋酸重悬、2500rpm/min离心、10～15分钟，弃上清，重复上述过程1次；4. 1％冰醋酸重悬，100℃孵育1～2小时，灭菌，无菌条件下2500rpm/min离心、10～15分钟，弃上清；5. 0.9％NaCl洗涤2～3次，蒸馏水洗涤2～3次，2500rpm/min离心、10～15分钟，弃上清；6.冻干，制得拟菌颗粒佐剂，-70℃保存。上述制备过程均在室温、常压下进行。本专利技术的拟菌颗粒佐剂应用于弱抗原疫苗的制备，如HBV、HIV、HCMV等，尤其用于偶联乙肝抗原，制作乙肝治疗疫苗、预防性疫苗；或者应用于抗肿瘤的后选药物。该拟菌颗粒佐剂(可来自一切人体益生菌如大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸菌等及一切对人体无害的细菌如枯草杆菌、济南假单胞杆菌等)因其来自非致病菌，安全，无毒，可广泛用于一切弱抗原疫苗的制备(如HBV、HIV、HCMV等)。用于体内外刺激T、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞的免疫增强剂(可用于骨髓抑制性疾病的治疗)，也可作为抗肿瘤的后选药物(实验显示在体外具有抑制并杀伤肿瘤原代细胞的作用)。具体地说本专利技术的拟菌颗粒佐剂具有强烈的免疫佐剂功能，尤其是刺激Th1方向的细胞免疫，并且细胞璧骨架中的多糖成分具有很强的吸附功能，能够吸附抗原形成“拟菌颗粒”而成为有效疫苗。实验证明，注射拟菌颗粒的动物均产生了与完全福氏佐剂相当的干扰素，NK杀伤达到福氏佐剂水平，具备了“理想佐剂”的品质和要求，现已用于偶联乙肝表面抗原，制作乙肝治疗疫苗；用于巨细胞灭活病毒抗原，制备人类巨细胞病毒疫苗；同时拟菌颗粒可以改变商业疫苗仅仅具有铝佐剂引起的体液免疫的现状，将有可能解决成人预防接种问题，如乙肝成人预防性疫苗接种问题。目前等待适当佐剂制作疫苗的病毒抗原很多，例如爱滋病的预防和治疗、人巨细胞病毒(引起先天畸形和先天智力发育不全，引起动脉粥样硬化等)的预防和治疗等。这些病毒均需要Th1方向的免疫刺激佐剂，拟菌颗粒佐剂在这些病毒疫苗研制领域将发挥更大作用。此外，肿瘤患者普遍存在Th1/Th2免疫偏移，CD8+淋巴细胞特异杀伤作用低能的现象，拟菌颗粒佐剂可与肿瘤抗原偶联，携带肿瘤抗原形成肿瘤疫苗，该瘤苗进入机体后，可以引起APC细胞的活跃识别和吞噬；拟菌颗粒佐剂可将空间表位暴露良好的抗原信息传递，经蛋白酶体相关酶降解，与内质网中合成的主要组织相容性抗原分子(MHC-1)结合，再转运到APC的表面，递呈到CD8+T细胞，与TCR-CD3结合成复合物，使CD8+T细胞活化，CD8+T肿瘤杀伤过程。同时，间接激活了Th中的Th1亚群，诱生了Th1型细胞因子(CK)IFN-r、IL-2、IL-12等及抗原特异的Th1型细胞因子调节的Th1型抗体IgG亚型IgG2a等，引起机体的抗肿瘤反应。由此可见，拟菌颗粒具有调整肿瘤患者的TH1/TH2免疫“漂移”现象的作用，具有潜在的抗肿瘤作用。下面结合对比实验，对拟菌颗粒佐剂的作用效果列表说明表1 小鼠免疫后10W血清抗-HBS的阳性率及平均效价组别 阳性率(％) 效价倒数(X±S)拟菌颗粒疫苗组 87.5 94.57±13.86完全福氏佐剂疫苗组 75 63±7.12商业乙肝疫苗对照组 50 11.89±14.28单纯抗原对照组 0x2检验结果示P＞0.05，可以推测拟菌颗粒疫苗组血清抗-HBS的阳性率高于商业疫苗组；与CFA组比较无明显差异；q检验示抗体效价在拟菌颗粒组、商业疫苗组及CFA组间无显著差异。表2 NK杀伤率测定(％)组别 X±S拟菌颗粒疫苗组40.07±6.23完全福氏佐剂疫苗组39.93±3.4商业乙肝疫苗对照组35.47±3.4单纯抗原对照组11.8±1.13u检验结果示拟菌颗粒疫苗组与抗原组比较的u值为39.2＞2.58，P＜0.01，二者有显著差异；与完全福氏佐剂比较的u值为0.221＜1.96，P＞0.05，二者无明显差异；与商业疫苗组比较的u值为5.29＞2.58，P＜0.01，二者有明显差异，可以认为拟菌颗粒组的NK杀伤率高于商业疫苗组。表3 扰素测定结果(IC50)组别 价倒数(X±S)拟菌颗粒疫苗 5164±1.205完全福氏佐剂 4159±1.218商业乙肝疫苗 672.976±1.524抗原对照 755±1.51q检验结果示抗原对照组与商业疫苗组无显著差异拟菌颗粒组与完全福氏佐剂组无显著差异；其他各组间均有显著差异。具体实施方式实施例1.1.选用菌种长型双歧杆菌(Bif 60-1)，以细菌的生长特性进行常规培养，收集细菌悬液，使浓度为1012/ml。2.用蒸馏水洗3次，丙酮洗2次，乙醚洗2次，时间8min，2500rpm/min离心，12分钟，弃上清，真空干燥、称重。使每升菌液制备干燥菌体约1.5克。3.取上述干燥菌体，每克菌体加入5％冰醋酸(用0.9％NaCl配制)18ml，洗涤、2500rpm/min离心、13分钟，弃上清，用1％冰醋酸重悬、2500rpm/min离心、11分钟，弃上清，重复上述过程1次。4. 1％冰醋酸重悬，100℃孵育1小时、灭菌，无菌条件下2500rpm/min离心、12分钟，弃上清。5. 0.9％NaCl洗涤3次，蒸馏水洗涤2次，2500rpm/min离心、13分钟，弃上清。6.冻干，制得拟菌颗粒佐剂，-70℃保存。上述制备过程均在室温、常压下进行。将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拟菌颗粒佐剂的制备方法，其特征在于，选用长型双歧杆菌（Ｂｉｆ ６↑［０］－１）、枯草芽孢杆菌ＡＰＣＣ９３７２之一的细菌悬液，浓度为：１０↑［１０］～１０↑［１３］／ｍｌ；依此用水、丙酮、乙醚洗涤，然后离心，弃上清，干燥，每升菌液制备干燥菌体约１～１．５克；再用５％冰醋酸洗涤，离心，弃上清，用１％冰醋酸重悬，离心，弃上清，重复上述过程１次；１％冰醋酸重悬，１００℃孵育１～２小时，灭菌，无菌条件下离心，弃上清；０．９％ＮａＣｌ洗涤，蒸馏水洗涤，离心，弃上清；冻干，制得拟菌颗粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟红，王玉梅，邢来田，
申请(专利权)人：山东省医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]