适用于同时糖化和发酵的重组宿主制造技术

本发明专利技术提供了重组宿主细胞，该细胞含有受能够增强多糖酶表达的取代启动子转录控制的至少一种编码多糖酶的异源多核苷酸。另外，本发明专利技术还提供了具有编码分泌蛋白的基因的上述宿主，以便有利于所表达的多糖酶的分泌。本发明专利技术的优选宿主是产生乙醇的，并且能够同时进行糖化和发酵，导致由复杂的纤维素底物产生乙醇。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关资料本申请要求题为“适用于同时糖化和发酵的重组宿主”的美国临时专利申请60/136376的优先权，该临时申请的申请日为1999年5月26日，它被以全文形式收作本文参考。在本说明书中所引用的所有专利、专利申请、和参考文献的内容，以其全文形式收作本文参考。政府资助的研究该研究得到了美国农业部、国家研究创造会(95-37308-1843；98-35504-6177)，和美国能源部(DE-FG02-96-ER200222)的部分资助。理论上讲，对于进口石油作为汽车燃料的问题的这种解决方案似乎十分简单。与使用石油不同，石油是一种有限的资源，而乙醇可以通过植物材料的发酵有效生产，它是一种可再生的资源。实际上，巴西已经证实了生产乙醇的可行性，并且用乙醇作为主要的汽车燃料使用了20年以上。类似地，美国每年生产超过12亿加仑的燃料乙醇。目前，燃料用乙醇是用酿酒酵母或运动发酵单胞菌，由玉米淀粉或甘蔗糖浆生产的。不过，这两种糖来源都不能满足实现取代基于石油的汽车燃料的需求。另外，糖和玉米淀粉是比较昂贵的原材料，它们还要被用作食品。另外，上述糖底物仅占植物中总碳水化合物的一部分。实际上，植物中碳水化合物的主要部分是木质素纤维素形式的，它是含有纤维素、半纤维素、果胶和木质素的具有复杂结构的聚合物。例如，木质素纤维素存在于植物的茎、叶、谷壳、外皮、和玉米芯中。水解上述聚合物能够释放出包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖在内的中性糖的混合物。尚未有已知天然生物能够将所有这些糖迅速有效地代谢成乙醇。然而，为了利用这种底物资源，海湾石油公司开发了一种用被称为同时糖化和发酵(SSF)的基于酵母的工艺，由纤维素生产乙醇的方法(Gauss等，1976，U.S.P.N.3990944)。将真菌纤维素酶制剂和酵母添加到一个容器中的纤维素底物的浆体中。在纤维素水解的同时产生了乙醇。不过，海湾石油公司的SSF工艺具有某些缺陷。例如，到目前为止，一直认为真菌纤维素酶在用于大规模生物乙醇工艺中时价格过于昂贵(Himmel等，(1997)Amer.Chem.Soc.pp.2-45；Ingram等，(1987)应用环境微生物学532420-2425；Okamoto等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.42563-568；Philippidis，G.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp.188-217；Saito等，(1990)J.Ferment.Bioeng.69282-286；Sheehan，J.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp 1-52；Su等，(1993)Biotechnol.Lett.15979-984)。本专利技术提供了一种工程生产的重组宿主细胞，以便增强适用于对复杂的碳水化合物进行解聚的多糖酶的表达和分泌。具体的例子是两种重组的肠道细菌大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌，它们能在一种取代启动子转录控制下高水平表达多糖酶。本专利技术提供了对上述宿主的进一步的改进，使它含有一种分泌蛋白，它能够提高细胞中多糖酶的产量。在一种优选实施方案中，所述多糖酶要么是以较大的量生产，要么具有较高的活性，或者是这两者的组合。在一种优选实施方案中，本专利技术提供了对上述宿主的进一步的改进，使其含有源于诸如运动发酵单胞菌的高效乙醇生产菌的外源产乙醇基因。因此，上述宿主能够表达高水平的蛋白，这种蛋白可以单独使用或者与其他酶或重组宿主组合使用，以便由复杂的碳水化合物产生乙醇。更具体地讲，在第一方面，本专利技术的特征是一种具有提高了的多糖酶产量的重组宿主细胞。这一方面的宿主细胞含有一个异源多核苷酸片段，该片段含有编码多糖酶的序列，其中，该序列受一种取代启动子转录控制，并且该启动子能够导致所述多糖酶的产量增加。另外，这一方面的特征是还含有第二种异源多核苷酸片段的宿主细胞，该片段含有编码一种分泌多肽的序列。所述第一和第二种异源多核苷酸片段的表达会导致重组宿主细胞的多糖酶产量、活性或其组合的提高。在一种优选实施方案中，所述多糖酶多肽是分泌型的。在另一种实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，优选为革兰氏阴性、兼性厌氧的，并且来自肠杆菌科。在另一种相关的实施方案中，所述重组宿主细胞是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属的，并且优选是以下菌株大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌KO4(ATCC55123)，大肠杆菌KO11(ATCC55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，大肠杆菌LY01，产酸克雷伯氏菌M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞含有一种多核苷酸片段，该片段编码一种多糖酶，该多糖酶是葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述多糖酶的组合。在一种相关实施方案中，所述多糖酶优选是葡聚糖酶，更优选是celZ基因的表达产物，最优选为源于菊欧文氏菌。在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞能表达由pul或out基因编码的分泌多肽，所述基因优选源于选自肠杆菌科的细菌细胞，更优选源于产酸克雷伯氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜黑腐亚种、或菊欧文氏菌。在另一种实施方案中，在所述重组宿主细胞中操纵基因表达的取代启动子源于来自运动发酵单胞菌的多核苷酸片段，更优选是SEQ IDNO1所提供的序列或该序列的片段。在另一种实施方案中，上述方面和上述实施方案中的宿主细胞是能产乙醇的。在第二方面，本专利技术提供了一种含有异源多核苷酸片段的重组产乙醇宿主细胞，所述多核苷酸片段编码一种多糖酶，并且，该片段是受外源取代启动子转录控制。在一种实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，优选为革兰氏阴性、兼性厌氧的，并且来自肠杆菌科。在另一种相关的实施方案中，所述重组产乙醇宿主细胞是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属的，并且优选是以下菌株大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌KO4(ATCC55123)，大肠杆菌KO11(ATCC55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，大肠杆菌LY01，产酸克雷伯氏菌M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞含有一种多核苷酸片段，该片段编码一种多糖酶，该多糖酶是葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、α-葡糖苷酶、内切-1，4-α-木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述多糖酶的组合。在一个相关实施方案中，所述多糖酶是葡聚糖酶，优选是celZ基因的表达产物，更优选为源于菊欧文氏菌。在另一种实施方案中，在所述重组宿主细胞中操纵基因表达的取代启动子源于来自运动发酵单胞菌的多核苷酸片段，更优选是SEQ IDNO1所提供的序列或该序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组宿主细胞，包括：含有受一种取代启动子转录控制的编码多糖酶多肽的序列的第一种异源多核苷酸片段，所述启动子能够导致所述多糖酶多肽的增强了的表达；和含有编码一种分泌多肽的序列的第二种异源多核苷酸片段，其中，所述第一和第二种多核苷酸片段的表达，会导致所述重组宿主细胞多糖酶产量的增加。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LO因格拉姆，S周，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]