D-葡糖酸内酯氧化酶基因以及生产重组D-葡糖酸内酯氧化酶的方法技术

本发明专利技术的目的在于分离编码Ｄ－葡糖酸内酯氧化酶（Ｄ－ＧＬＯ）的核酸分子，所述Ｄ－葡糖酸内酯氧化酶用于通过转化Ｄ－葡糖酸内酯而生产异抗坏血酸。设想了对所述核酸分子的各种改进，包括保持天然Ｄ－ＧＬＯ的酶促活性的编码蛋白。优选利用本发明专利技术核酸以合适表达载体转化的各种宿主细胞产生Ｄ－葡糖酸内酯氧化酶的重组方法。还设想了在转化葡萄糖、尤其是转化Ｄ－葡糖酸内酯成为异抗坏血酸的过程中利用本发明专利技术的Ｄ－ＧＬＯ的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码葡糖酸内酯氧化酶的新型核酸分子，所述酶可用于生产异抗坏血酸及相关盐的方法。异抗坏血酸是抗坏血酸的C-5表异构物，具有基本相同的化学特性，如抗氧化剂活性。然而，与抗坏血酸的维生素C活性相比，异抗坏血酸的维生素C活性非常低，因此在实际应用中人们并不认为异抗坏血酸是维生素。异抗坏血酸属于GRAS情况，在许多食品和其它应用中用作抗氧化剂。目前用于生产异抗坏血酸的化学方法以下面所述反应为基础酯化2-酮葡糖酸，然后碱催化该酯环化产生异抗坏血酸钠。自六十年代起，人们就知道某些属于青霉属(Penicillium)的野生型真菌当在葡萄糖上培养时产生少量异抗坏血酸。通过广泛化学诱变/选择程序，已经分离出能够转化葡萄糖为异抗坏血酸的产率达40％的特异青霉(Penicillium notatum)菌株。然而，需要完成所述转化的发酵时间非常长(1-2周)，这使该生产方法不能工业化。随后对青霉属中从葡萄糖到异抗坏血酸途径的酶学研究确定该途径由两个反应组成。第一个反应是众所周知的，由葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化为葡糖酸内酯。该途径的第二个反应是分子氧将D-葡糖酸内酯氧化，形成异抗坏血酸和过氧化氢。该反应由D-葡糖酸内酯氧化酶(D-GLO)催化，该酶仅在几种真菌中检测到。Takahashi及其合作者已经阐明了一种蓝棕青霉(Penicillium cyaneofulvum)(随后重新分类为Penicillium griseoroseum ATCC 1043)菌株的D-GLO基本酶学特性。以经济上可接受的速率使葡萄糖直接转化为异抗坏血酸的有关难题仍然没有得到解决。本专利技术提供编码D-GLO的分离核酸，其中所述D-GLO可用于生产异抗坏血酸及其盐的生物技术方法。本专利技术涉及分离和鉴定编码用于生产异抗坏血酸及相关盐的D-葡糖酸内酯氧化酶(D-GLO)的核酸分子。因此，在一个实施方案中，本专利技术涉及SEQ ID NO1(cDNA)、SEQ ID NO2(编码)和SEQ ID NO3(成熟)定义的新分离的核酸分子。本专利技术还考虑了在严格条件下与SEQ.ID.NOS.1-3中的任一种杂交的核酸分子。在本专利技术的另一实施方案中，还提供包含本文鉴定的任何一种核酸分子的载体以及用这种载体转化的宿主细胞。本专利技术还考虑了使用所鉴定的核酸分子产生D-GLO的重组方法。本专利技术的再一实施方案涉及由本文鉴定的核酸分子所编码的D-GLO蛋白，其中包括SEQ ID NO4表示的蛋白和与SEQ ID NO4具有至少70％序列同一性的蛋白。在本专利技术的又一实施方案中，还提供使用本专利技术的D-GLO转化葡萄糖和/或D-葡糖酸内酯生产异抗坏血酸和相关盐的方法。附图说明图1图解说明编码P.Griseoroseum GLO的MFα1前原肽(prepropepetide)和成熟部分的质粒pGTY(GLO)。图2图解说明未转化的啤酒酵母(S.cerevisiae)和pGTY(GLO)转化的啤酒酵母的细胞密度和GLO活性。图3图解说明利用葡萄糖氧化酶和D-GLO使葡萄糖转化为D-异抗坏血酸。图4图解说明利用葡萄糖脱氢酶和D-GLO使葡萄糖转化为D-异抗坏血酸。图5图解说明包含巴斯德毕赤酵母启动子控制下的D-GLO基因完整编码区的质粒pPIC3.5K(GLO)。本专利技术涉及编码真菌来源的D-GLO的分离的核酸分子。所述真菌最好属于青霉属，如Penicillium griseoroseum、特异青霉、蓝青霉(Penicillium cyaneum)和斜卧青霉(Penicillium decumbens)。本文所用的术语“D-葡糖酸内酯氧化酶”(D-GLO)是指并且包括任何天然或人造的真菌D-GLO变异体。例如，编码真菌D-GLO的本专利技术核酸分子可以具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列；或者具有这样的序列在严格条件下与具有SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的分离的核酸分子杂交的序列；或者具有编码这样的蛋白的序列所述蛋白当与SEQ ID NO4氨基酸序列比较时，具有约70％或更高的序列同一性。约70％或更高的氨基酸同一性可以定义为根据在国际互联网站点http//www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-bin/BLAST/上执行的BLASTP算法，使用该程序的默认参数(矩阵(Matrix)＝Blosum 62；缺口罚分(Gap existence cost)＝11；缺口延伸罚分(Gap extension cost)＝1)进行搜索的正百分率。更具体地说，本专利技术的核酸分子包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的变异形式，如缺失、插入、添加和突变，其中这样的序列编码保持天然D-GLO的酶促活性的蛋白，即所编码的蛋白能够转化D-葡糖酸内酯成为异抗坏血酸。包含本专利技术所述核酸分子的载体以及转化宿主细胞或转基因生物也包括在本专利技术的范围内。“载体或表达载体”是指包含用于包括但不限于在原核或真核细胞或生物中表达的调节元件或报道基因的任何核酸分子或病毒。“转化宿主细胞”是指其中已经通过分子生物学技术引入编码D-GLO的核酸的宿主细胞，其中所述核酸最好来自真菌，最优选来自青霉属真菌。在将所述核酸引入所述细胞后，所述核酸可以在染色体外存在或整合入宿主基因组。对于本领域内的技术人员来说，下列操作是常规性的构建其中本专利技术的核酸分子与所需启动子有效连接的表达载体，以便在各种宿主中表达和分泌所述核酸分子编码的D-GLO蛋白。Sambrook，等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可用于实施本专利技术的宿主细胞可以是任何适用于转化程序的可获得宿主细胞。例如，可以使用细菌细胞，例如属于埃希氏菌属(Eschericha)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)或假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌。也可以使用酵母细胞作为宿主细胞，例如属于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)和许旺酵母属(Schwanniomyces)的酵母。也可以使用单细胞藻类，例如集胞藻属(Synechosystis)、衣藻属(Chlamydomonas)和裸藻属(Euglena)的单细胞藻类。也可以用本专利技术的分离的核酸转化高等植物细胞。用裸DNA或用包含与异源基因有效连接、在植物中起作用的启动子的载体转化植物细胞的方法是本领域内众所周知的。代表性的植物包括大豆、玉米、马铃薯、番茄、甜菜等等。也可以使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。表达的GLO最好靶向培养基或一种细胞器，例如液泡、叶绿体、微粒体、过氧化物酶体等等。术语“核酸或核酸分子”包括RNA和DNA，其中包括cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成或修饰)DNA。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，该核酸分子编码Ｄ－葡糖酸内酯氧化酶。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A米亚斯尼科夫，T萨卢斯亚维，H奥亚莫，
申请(专利权)人：丹尼斯科卡尔特美国有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]