合成有机产物的方法和材料技术

本发明专利技术提供了用于生产乳酸盐的生物催化剂，它是含有重组表达载体的重组酵母细胞，该载体编码异源性乳酸脱氢酶基因。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于生产有机产物的方法和材料。2.背景信息诸如乳酸的有机产物具有许多重要的工业用途。例如，有机酸可用于合成塑料材料以及其它产品。为了满足对有机产物不断增长的需要，有待开发更有效且成本更实际的生产方法。一个这类方法涉及使用细菌。更具体地说，某些细菌在某些发酵条件下可产生大量的特定有机产物。然而，使用活细菌作为生产者受到随着有机产物在生长培养基中的积累细菌不能生长的限制。为了绕开该限制，在产物合成期间采用了各种产物纯化技术。另外，已经尝试了使用非细菌的微生物。事实上，在生产乳酸的尝试中已经遗传修饰了已知具有酸耐受性的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。具体地说，通过给细胞提供牛乳酸脱氢酶cDNA并破坏内源性丙酮酸脱羧酶基因(PDC1，PDC5，和PDC6)修饰了酿酒酵母细胞。尽管这些修饰的酿酒酵母细胞产生了一些乳酸，但是细胞生长受到抑制，因此细胞生长和乳酸生产均需要改进。专利技术概述本专利技术一般涉及生产有机产物的方法和材料。具体地说，本专利技术提供了酵母细胞，培养酵母细胞的方法，制备酵母细胞的方法，核酸构建体，和产生各种有机产物的方法和材料。本专利技术基于这样的发现，即特定微生物(例如，细菌和真菌微生物)可遗传构建成在特定培养条件下具有生长能力，利用各种碳源用于生长以及产物生产，并产生用于商业目的的所需有机产物。例如，本文提供的酵母细胞在低pH和高温培养时可生长并产生有机产物。具有在例如，低pH和高温条件下迅速生长并高效产生有机产物的能力特别具有优势。具体地说，微生物耐受低pH的能力避免了需要在大规模生产过程中有困难且昂贵的维持中性pH环境。另外，从低pH培养基回收目的有机产物所需的方法和材料比从具有更中性pH的培养基中回收相同有机产物所需的方法和材料更实际且更有效。例如，某些有机酸产物随着pH下降到产物pKa值以下可能在溶液中沉淀出来，使得回收十分简单。另外，微生物耐受高温的能力避免了在生长和生产期间需要维持凉爽温度。很明显，减少对大规模生产过程中降低大容积罐温度的需要使得整个过程更有效且花费更低。而且，微生物同时耐受低pH和高温的能力提供了在大规模生产过程中防止被其它耐受性较小的微生物污染的方便方法。重要的是应注意与产生用于商业目的的所需有机产物的能力相关的重要方面可以是产生所需有机产物的单位生产率(specific productivity)。例如，使用本文所述的方法和材料提供的高单位生产率可允许微生物当暴露在诸如低pH和高温的培养条件下时产生细胞维持所需的能量。该所需能量可在基本上厌氧的条件下通过发酵途径产生，而不是依赖于通过呼吸途径产生能量。当产生有机产物不需要呼吸途径时通过发酵途径获得能量特别具有优势，因为基本上所有的供给碳源可用于生产所需有机产物。本专利技术也基于这样的发现，即可控制某些遗传构建的微生物对碳源的利用并主要定向产生生物量或者所需的有机产物。一般来说，本专利技术包含两种类型的培养方法。一种培养方法涉及依赖于微生物和所需结果，在促进生物量生产的特定培养条件下培养微生物，而另一培养方法涉及也依赖于微生物和所需结果，促进所需有机产物生产的一套不同的培养条件。很明显，在大规模生产过程中具有控制碳源利用的能力提供了比其它可能具有更大灵活性和更多控制的生产者。另外，本专利技术基于这样的发现，即可对某些微生物进行遗传操作，以便大多数(如果不是全部的话)碳源被用于生产生物量或者所需的有机产物。具体地说，本专利技术提供了经过修饰以便从生物量或者所需有机产物的生产转移碳源利用的生物合成途径被失活的酵母细胞。失活该生物合成途径提供了可有效生长并产生所需产物的微生物。一般来说，本专利技术的特征在于含有外源性核酸分子的酵母细胞，其中外源性核酸分子编码在细胞内具有酶活性的多肽。该核酸可插入细胞基因组中。该酶活性导致有机产物的形成，在某些实施方案中，该有机产物从细胞中分泌出来。该细胞还具有crabtree-阴性表型且产生该有机产物。例如，该细胞可来自Kluyveromyces，Pichia，Hansenula，Candida，Trichosporon，或Yamadazyma属。该有机产物可以是，例如，发酵产物，丙酮酸盐衍生的产物，有机酸，或诸如乳酸盐(lactate)的羧酸盐。在一个实施方案中，该多肽可具有乳酸脱氢酶活性。例如，外源性核酸可编码细菌乳酸脱氢酶或诸如K.lactis真菌乳酸脱氢酶的真菌乳酸脱氢酶。在另一实施方案中，细胞含有4个外源性核酸分子，4个外源性核酸分子各编码一个不同的多肽。例如，4个外源性核酸分子中的第一个可编码具有乳酸脱氢酶活性的第一多肽，第二核酸分子可编码具有CoA-转移酶活性的第二多肽，第三核酸分子可编码具有乳酰-CoA脱水酶活性的第三多肽，且第四核酸分子可编码具有丙烯酰基-CoA水合酶活性的第四多肽。这种细胞可产生丙烯酸盐作为羧酸盐产物。作为选择，4个外源性核酸分子中的第一个可编码具有2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶活性的第一多肽，第二核酸分子可编码具有木糖酸(xylonate)脱水酶活性的第二多肽，第三核酸分子可编码具有木糖酸内酯酶(xylonolactonase)活性的第三多肽，且第四核酸分子可编码具有D-木糖脱氢酶活性的第四多肽。这种细胞可产生诸如D-木糖的糖类作为有机产物。在另一实施方案中，细胞含有6个外源性核酸分子，6个外源性核酸分子各编码一个不同的多肽。例如，6个外源性核酸分子中的第一个可编码具有2，5-二氧戊酸(2，5-dioxovalerate)脱氢酶活性的第一多肽，第二核酸分子可编码具有5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶活性的第二多肽，第三核酸分子可编码具有葡糖二酸(glucarate)脱水酶活性的第三多肽，第四核酸分子可编码具有乙醛脱氢酶活性的第四多肽，第五核酸分子可编码具有葡糖醛酸内酯还原酶活性的第五多肽，第六核酸分子可编码具有L-古洛糖酸内酯氧化酶活性的第六多肽。这种细胞可产生诸如L-抗坏血酸盐的维生素作为有机产物。该有机产物可含有3个以上碳原子，例如可以是氨基酸。在另一实施方案中，该细胞能分解代谢诸如核糖，阿拉伯糖，木糖和来苏糖的戊糖碳。在另一实施方案中，该细胞具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。例如，该细胞可缺乏所有的丙酮酸脱羧酶活性。丙酮酸脱羧酶活性降低可以是由于遗传基因座破坏，其中该基因座正常情况下具有编码丙酮酸脱羧酶的核酸序列。作为选择，该细胞可含有相应于内源性核酸序列的诸如核酶的反义分子，其中该反义分子降低了丙酮酸脱羧酶的活性。细胞也可含有充当杀伤质粒的其它外源性核酸分子。在另一实施方案中，外源性核酸编码的多肽的酶活性导致以NADH消耗方式形成有机产物。在另一实施方案中，当在生产有机产物的最佳条件下培养细胞时，每消耗100克葡萄糖细胞产生至少大约60克的有机产物。在另一方面，本专利技术的特征在于含有外源性核酸分子的细胞，例如，酵母细胞，其中外源性核酸分子编码促进戊糖碳被细胞分解代谢的多肽。该多肽可以是，例如，木糖还原酶，木糖醇脱氢酶，或木酮糖激酶，且该戊糖碳可以是，例如，核糖，阿拉伯糖，木糖，和来苏糖。该细胞还可分解代谢己糖碳且如果需要，可同时分解代谢己糖碳和戊糖碳。己糖碳可以是，例如，阿洛糖，阿卓糖，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸，它编码具有以Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．２２鉴定的氨基酸序列的酵母乳酸脱氢蛋白。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：文尼特拉杰加希亚，默加潘蒂拉，劳拉劳霍南，马加伊尔曼，卡里科伊沃兰塔，
申请(专利权)人：加吉尔道聚合物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]