制造氨基化合物的微生物学方法技术

本发明专利技术涉及一类新的微生物，它们可以耐受至少３Ｍ浓度的乙腈溶液；并且本发明专利技术还涉及用该类微生物和相应的腈制备具有通式（ＩＩＩ）的氨基化合物的方法，其中Ｒ＃＋［１］为Ｃ＃－［１－６］烷基、Ｃ＃－［２－６］烯基或者是通式（ＩＶ）的基团，通式ＩＶ中，Ｘ是氮原子或者－ＣＨ＝，Ｒ＃＋［２］和Ｒ＃＋［３］是彼此独立的氢原子、卤素原子、Ｃ＃－［１－６］烷基或者Ｃ＃－［２－６］烯基。本发明专利技术进一步涉及用上述的微生物来清理乙腈废物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可以耐受至少3M乙腈溶液含量的微生物、一种具有腈水合酶活性的酶、一种用上述的酶或微生物来制造氨基化合物的方法，以及应用上述的微生物来清理乙腈废物。
技术介绍
已知许多生物技术方法可以用来制造氨基化合物，例如，烟酰胺，它是一种对于动物和人类都必不可少的属于维生素B族的维生素。例如，EP-A 0 307 926公开了一种通过Rhodococcus rhodochrous J1将3-氰基吡啶转化为烟酰酐的方法。这种方法的缺点是红色的Rhodococcusrhodochrous J1致使产物污染。而且，微生物对于底物3-氰基吡啶有很高的米氏常数值(Km)，对于3-氰基吡啶和温度的耐受能力都比较低。又如，WO 99/05306公开了一种通过红球菌属(Rhodococcus)、土壤丝菌属(Amycolatopsis)和放线菌属(Actinomadura)的微生物用相应的腈制造烟酰胺的方法。这种方法的缺点是所用到的土壤丝菌属微生物在较高的温度下会失活。另外，这种微生物对于3-氰基吡啶和烟酰酐的耐受能力都比较低。而所说的红球菌属的微生物对于3-氰基吡啶有很高的米氏常数值，而且温度稳定性差。因此，该方法在工业生产中并不经济。本专利技术的目的是提供一些微生物，它们相对稳定并且对于底物(例如3-氰基吡啶)具有相对低的米氏常数值，从而可以提供更经济的，可以大量的、高纯度的分离出氨基化合物的方法。该目的通过权利要求1中所述的微生物，权利要求5-7中所述的酶，以及权利要求8中所述的方法来实现。本专利技术中的微生物可以在一般的微生物技术帮助下，通过对土壤样本、矿泥以及废水进行适当的处理得到。它们可以通过在一种分子式为 的吡啶醛肟或者腈作为碳源，在有钴离子以及例如酵母浸膏和/或铵盐的条件下培养，而提取出来。这样就可以从培养基中得到可承受至少3M乙腈浓度的微生物，并且可以把腈，例如-氰基吡啶和乙腈转化成相应的氨基化合物。可能用的吡啶醛肟一般为吡啶-2-，吡啶-3-或者吡啶-4-醛肟。适合选择的腈尤其指那些在后来的生物转化中打算被用作底物的腈，例如乙腈(乙酸腈)、丙腈、丁腈、巴豆酸腈、乙二酸腈和丙二酸腈。首选的钴离子源主要是可以产生钴离子的钴合物，例如Co2+和Co3+的盐，比如钴的氯化物、钴的硫酸盐和钴的醋酸盐。而首选的钴的化合物是Co2+的盐，例如CoCl2。但是，也可能是和金属钴或者其它的钴的化合物组合使用。通常，在培养基中，钴或钴化合物的量为1-30毫克/升，最适宜的是1-20毫克/升。用到的铵盐可能是磷酸盐，例如，(NH4)2HPO4或者(NH4)H2PO4。在实际的生物转化以前，微生物要在适当的培养基中培养，在表3和5中列举了一些适宜的培养基。培育通常在温度20-40℃、PH值为5.0-8.0的环境中进行，而最适宜的条件是温度25-35℃、PH值6.0-7.5。在培养过程中，通过加入酶诱导剂，能很方便地诱导出活性酶，也就是腈水合酶。可能用到的酶诱导剂是饱和的或者不饱和的脂肪腈或者相应的氨基化合物。用到的脂肪腈是C2-7-烷腈，例如丁腈、异丁腈、戊腈何异戊腈，或者是C3-7-烯腈，例如甲基丙烯腈或者巴豆腈。用到的脂肪氨基化合物是任何C2-7-烷酰胺，例如丁酰胺、异丁酰胺、戊酰胺或者丙酰胺，或者C3-7-烯酰胺，例如，甲基丙酰胺或者巴豆酰胺。优选的酶诱导物是甲基丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺、戊酰胺、甲基丙烯腈、巴豆酰胺、丁腈和异丁腈。最优选的酶诱导物是甲基丙烯腈。本专利技术的微生物可以承受至少3M的乙腈浓度，意味着在0.1M钾磷酸缓冲液中与3M的乙腈溶液，在PH7.0和20℃的条件下培育一个小时后酶的活性仍然稳定，也就是说损失了不到10％的活性。优选的微生物在上面的条件下，可以在浓度至少为6M的乙腈中耐受一个小时，而损失的活性少于50％。特别优选的微生物在上面的条件下，可以在浓度至少为9M的乙腈中耐受一个小时，而损失的活性少于70％。极特别优选的微生物，在15M和19M的乙腈(对应于纯乙腈)中培育几分钟后，酶的活性仍然是稳定的。这样，在15M的乙腈中培育10分钟后，酶活性的损失少于10％。本专利技术中的微生物有很高的热稳定性，也就是说，在高温下比目前已知的微生物更稳定。本专利技术的微生物，在0.1M的磷酸钾缓冲液中，PH7.0，60℃的条件下培育一个小时后，酶活性的损失少于10％，而且，在同样条件下培育2小时酶损失的活性少于40％。这里所说的酶活性是指腈水合酶的活性，特别是和底物3-氰基吡啶有关的腈水合酶活性。本专利技术微生物的其他的特点包括，对于优选的被用作底物的3-氰基吡啶以及产物烟酰胺具有较高的耐受能力，对于3-氰基吡啶有比较低的米氏常数值。另外，一个非常突出的特点在于它们可以在比30℃时乙酰胺饱和溶液的浓度(近似于100ml水中220-230g乙酰胺)更高的浓度下积累乙酰胺。优选的微生物属于红球菌属(Rhodococcus)。特别是Rhodococcus sp.FZ4菌株和与其功能等价的变种以及它的突变体。功能上等价的变种以及它的突变体是指可以承受乙腈的浓度至少为3M的菌株。尤其优选的微生物是无色素的红球菌株，也就是缺乏会污染产物的红色素的菌株。适当的条件下，可以通过UV射线或者诱导突变的化学药品，从生成色素的微生物中突变得到这些菌株。菌株Rhodococcus sp.FZ4由德国菌种保存中心(DSMZ)(地址Mascheroder Weg 1b，D-38 124 Braunschweig)于2000年7月11日，按照布达佩斯条约编号为DSM 13597。根据它的鉴别数据，不可能把它和已知的任何红球菌属归为一类，所以就把它当成一个新的物种。功能上相等的Rhodococcus sp.FZ4菌株的变种和突变体可以产生自发的突变，或者在诸如UV射线和诱发突变的化学物质的作用下突变。优选的Rhodococcus sp.FZ4菌株的变种或者突变体是无色素的，也就是说，它们没有可以污染产物的红色素。酶浸膏可以通过分解微生物等方法得到，例如，通过超声波、费氏压碎机或者溶菌酶方法。本专利技术中有腈水合酶活性的酶可以从上面描述的微生物中得到。最适合的微生物是红球菌属的微生物，特别是Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)。所述的酶具有如下性质a)在20℃，PH值7.0的条件下，0.05M磷酸钾缓冲溶液中，对于底物乙腈的米氏常数值为2.84±1.00mM，而对于底物3-氰基吡啶为80.5±15.0mM；b)在20℃，0.05M的磷酸钾缓冲溶液中，最适宜的pH值为6.5±1.0.特别的，所提到的酶具有c)由高效液相层析测得的固有分子量为465±50kDa。实际操作中的生物转化可以通过上述的微生物、该微生物的酶提取物或者独立的酶来完成。优选的微生物为Rhodococcus sp.FZ4。可以用在生物转化过程中的底物是具有下述分子通式的腈R1-CN II. 在通式II中，取代基R1是C1-6-烷基，C2-6-烯基或者是通式IV的基团。 通式IV中，X是氮原子或者-CH＝，R2和R3是彼此独立的氢原子、卤素原子、C1-6烷基或者C2-6烯基。可用的C1-6烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物，其特征在于它可以耐受至少３Ｍ浓度的乙腈溶液。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：卡伦特雷丝罗宾，长泽透，
申请(专利权)人：隆萨股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]