一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法技术

本发明专利技术涉及一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，该方法包括以下步骤：⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液均分后离心，得到菌体沉淀A、B；⑵菌体沉淀A和B分别清洗后再次离心，得到清洗后的菌体沉淀A、B；⑶在清洗后的菌体沉淀A中加无菌水，经振荡处理、稀释，并测定600nm处OD值，记为ODx；⑷在清洗后的菌体沉淀B中加乙醇水溶液，经振荡处理并测定600nm处OD值，记为ODe；⑸乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODp；⑹稀释后的酵母菌液接种到YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODy；⑺以ODx为横坐标，ODy为纵坐标，拟合得到y=ax+b的公式；⑻ODp代入y=ax+b后，得x值；⑼将x/ODe的值定义为耐受值。本发明专利技术操作简单、适用范围广。

An evaluation method for ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae

【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法
本专利技术涉及微生物对代谢产物耐受性的研究领域，尤其涉及一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法。
技术介绍
生物质能是重要的可再生能源，具有绿色、低碳、清洁、可再生等特点。加快生物质能开发，利用甜高粱茎秆、薯类作物等非粮生物质为原料生产燃料乙醇，是推进能源生产和消费革命的重要内容，是改善环境质量、发展循环经济的重要任务。发酵糖浓度一般在16~23%（w/v）左右，发酵完毕后的醪液中乙醇浓度在8~12%左右（v/v），发酵液中，乙醇浓度低导致精馏能耗高，废糟液量大，所以提高发酵终点乙醇浓度对降低蒸馏能耗，减少废糟液处理能耗，保护环境，提高企业经济效益具有重要的现实意义。但是，乙醇浓度升高会对发酵过程中酵母细胞的生长产生胁迫作用，抑制酵母细胞生长、存活及发酵能力，酵母细胞为了生存、生长会产生相应的应激反应来应对这种胁迫，这种应对机制即酵母对乙醇产生了耐受性。所以，在生产过程中，建立一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，可为高耐受及高产酿酒酵母的选育提供便捷，也可为研究微生物抵御不良环境的生理机制提供技术方法。目前，高浓度乙醇冲击下酵母细胞的存活率被广泛用于评价酵母的乙醇耐受性以及反映了营养条件和培养环境对耐受性的影响。基于该方法，酵母经高浓度乙醇冲击后，存活率的计算一般采用：酵母菌液稀释不同倍数涂布平板计数或者美兰染色后在显微镜下计数两种方法。但是这两种方法容易受到操作过程影响，酵母在平板上生长较慢、容易染菌，存在涂布不均匀无法计数的问题，并且涂布平板数量足够多才具有统计意义；美兰染色法只适用于死、活酵母细胞的区分，对于处于休眠状态的酵母无法通过染色判断死活，存在计数误差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、适用范围广的酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法。为解决上述问题，本专利技术所述的一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，包括以下步骤：⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液40mL，均分到两个50mL的离心管中离心，分别得到菌体沉淀A、菌体沉淀B；⑵所述菌体沉淀A和所述菌体沉淀B分别采用20~40mL无菌水清洗后再次离心，得到清洗后的菌体沉淀A、清洗后的菌体沉淀B；⑶在所述清洗后的菌体沉淀A中加入20~40mL无菌水，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶A，经振荡处理得到无菌水处理的酵母菌液；该无菌水处理的酵母菌液采用无菌水分别稀释成20%、40%、60%、80%、100%体积浓度的酵母菌液，并测定600nm处OD值，记为ODx；⑷在所述清洗后的菌体沉淀B中加入20~40mL体积浓度为8~18%的乙醇水溶液，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶B，经振荡处理得到乙醇水溶液处理的酵母菌液，并测定600nm处该乙醇水溶液处理的酵母菌液OD值，记为ODe；⑸将200~1000μL所述乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到20mLYPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODp；⑹将200~1000μL所述步骤⑶稀释后的酵母菌液接种到20mLYPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODy；⑺以ODx为横坐标，ODy为纵坐标，在excel表格中绘制散点图，拟合得到y=ax+b的公式，其中a、b为拟合公式中的已知参数；⑻ODp作为公式中的y值，代入y=ax+b后，得到x值；⑼将x/ODe的值定义为酿酒酵母经乙醇水溶液处理后的耐受值；当x/ODe=1时，表示酵母生长或存活不受乙醇水溶液影响，耐受度为100%；当x/ODe=0时，表示酵母全部死亡，耐受度为0；当0<x/ODe<1，比值越靠近1表示酵母乙醇耐受性越大；当1<x/ODe≤1.1表示实验结果有误差，但在允许范围之内。所述步骤⑴和所述步骤⑵中离心的条件是指速率为4000~5000rpm/min，时间为3~5min。所述步骤⑶和所述步骤⑷中振荡处理的条件是指温度为28~30℃、速率为150~200rpm、时间为3~4h。所述步骤⑸和所述步骤⑹中振荡培养的条件是指温度为28~30℃、速率为150~200rpm、时间为10~20h。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术与涂布平板计数的方法相比，酵母经乙醇溶液处理后，从稀释到涂布平板，再到菌落长出，一般需要12~60h，而利用测定600nm处OD值拟合公式的方法，只需要10~20h，缩短了操作时间，也解决了涂布不均匀无法计数、染菌及涂布所需平板数量过多等问题。2、本专利技术与美兰染色显微镜观察计数相比，酵母经乙醇溶液处理后，会有部分细胞处于休眠状态，但未致死，肉眼在显微镜下观察容易出现误差，并且团状菌体无法准确计数。而本专利技术中所述的方法，是将乙醇处理后的菌液接入YPD培养基中继续培养，休眠的细胞会在液体培养基中复苏，团状菌体在振荡培养过程中会散开，避免了实验操作误差，并且利用酶标仪测定OD值时，平行取样方便，检测迅速，能最大程度避免实验误差。3、本专利技术操作简单，除了适用于评价不同浓度乙醇冲击下的酿酒酵母耐受性外，还可用乙酸、过氧化氢、重金属等物质替代乙醇，评价酿酒酵母对多种物质的耐受性。具体实施方式一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，包括以下步骤：⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液40mL，均分到两个50mL的离心管中，在速率为4000~5000rpm/min的条件下分别离心，3~5min后得到菌体沉淀A、菌体沉淀B。⑵菌体沉淀A和菌体沉淀B分别采用20~40mL无菌水清洗后再次在速率为4000~5000rpm/min的条件下离心，3~5min后得到清洗后的菌体沉淀A、清洗后的菌体沉淀B。⑶在清洗后的菌体沉淀A中加入20~40mL无菌水，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶A，于28~30℃以150~200rpm的速率振荡处理3~4h，经振荡处理得到无菌水处理的酵母菌液；该无菌水处理的酵母菌液采用无菌水分别稀释成20%、40%、60%、80%、100%体积浓度的酵母菌液，并测定600nm处OD值，记为ODx。⑷在清洗后的菌体沉淀B中加入20~40mL体积浓度为8~18%的乙醇水溶液，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶B，于28~30℃以150~200rpm的速率振荡处理3~4h，经振荡处理得到乙醇水溶液处理的酵母菌液，并测定600nm处该乙醇水溶液处理的酵母菌液OD值，记为ODe。⑸将200~1000μL乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到20mLYPD培养基中，于28~30℃以150~200rpm的速率振荡培养10~20h，经振荡培养后测定OD值，记为ODp。其中：YPD培养基是指将酵母膏、蛋白胨、葡萄糖按照1%、2%、2%的质量比溶于蒸馏水，于121℃灭菌20min后得到的混合溶液。YPD培养基也可以采用市售产品。⑹将200~1000μL步骤⑶稀释后的酵母菌液接种到20mLYPD培养基中，于28~30℃以150~200rpm的速率振荡培养10~20h，经振荡培养后测定OD值，记为ODy。⑺以ODx为横坐标，ODy为纵坐标，在excel表格中绘制散点图，拟合得到y=ax+b的公式，其中a、b为拟合公式中的已知参数。⑻ODp作为公式中的y值，代入y=ax+b后，得到x值。⑼将x/ODe的值定义为酿酒酵母经乙醇水溶液处理后的耐受值。当x/ODe=1时，表示酵母生长或存本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，包括以下步骤：⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液40mL，均分到两个50mL的离心管中离心，分别得到菌体沉淀A、菌体沉淀B；⑵所述菌体沉淀A和所述菌体沉淀B分别采用20~40mL无菌水清洗后再次离心，得到清洗后的菌体沉淀A、清洗后的菌体沉淀B；⑶在所述清洗后的菌体沉淀A中加入20~40mL无菌水，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶A，经振荡处理得到无菌水处理的酵母菌液；该无菌水处理的酵母菌液采用无菌水分别稀释成20%、40%、60%、80%、100%体积浓度的酵母菌液，并测定600nm处OD值，记为ODx；⑷在所述清洗后的菌体沉淀B中加入20~40mL体积浓度为8~18%的乙醇水溶液，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶B，经振荡处理得到乙醇水溶液处理的酵母菌液，并测定600nm处该乙醇水溶液处理的酵母菌液OD值，记为ODe；⑸将200~1000μL所述乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到20mL YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODp；⑹将200~1000μL所述步骤⑶稀释后的酵母菌液接种到20mL YPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODy；⑺以ODx为横坐标，ODy为纵坐标，在excel表格中绘制散点图，拟合得到y=ax+b的公式，其中a、b为拟合公式中的已知参数；⑻ODp作为公式中的y值，代入y=ax+b后，得到x值；⑼将x/ODe的值定义为酿酒酵母经乙醇水溶液处理后的耐受值；当x/ODe=1时，表示酵母生长或存活不受乙醇水溶液影响，耐受度为100%；当x/ODe=0时，表示酵母全部死亡，耐受度为0；当0<x/ODe<1，比值越靠近1表示酵母乙醇耐受性越大；当1<x/ODe≤1.1表示实验结果有误差，但在允许范围之内。...

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母乙醇耐受性的评价方法，包括以下步骤：⑴收集对数生长期的酿酒酵母悬浮液40mL，均分到两个50mL的离心管中离心，分别得到菌体沉淀A、菌体沉淀B；⑵所述菌体沉淀A和所述菌体沉淀B分别采用20~40mL无菌水清洗后再次离心，得到清洗后的菌体沉淀A、清洗后的菌体沉淀B；⑶在所述清洗后的菌体沉淀A中加入20~40mL无菌水，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶A，经振荡处理得到无菌水处理的酵母菌液；该无菌水处理的酵母菌液采用无菌水分别稀释成20%、40%、60%、80%、100%体积浓度的酵母菌液，并测定600nm处OD值，记为ODx；⑷在所述清洗后的菌体沉淀B中加入20~40mL体积浓度为8~18%的乙醇水溶液，混合均匀后倒入50mL无菌锥形瓶B，经振荡处理得到乙醇水溶液处理的酵母菌液，并测定600nm处该乙醇水溶液处理的酵母菌液OD值，记为ODe；⑸将200~1000μL所述乙醇水溶液处理的酵母菌液接种到20mLYPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODp；⑹将200~1000μL所述步骤⑶稀释后的酵母菌液接种到20mLYPD培养基中，经振荡培养后测定OD值，记为ODy；⑺以ODx为横坐标，OD...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆栋，郭晓鹏，张苗苗，李文建，高越，
申请(专利权)人：中国科学院近代物理研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62