用于检测产β‑内酰胺酶的细菌的存在的新方法技术

本发明专利技术涉及用于体外测定可能含有产内酰胺酶的细菌的样品中所述细菌的存在的电化学方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测产β-内酰胺酶的细菌的存在的新方法
本专利技术涉及用于通过其产生β-内酰胺酶的能力检测样品或培养基中耐受β-内酰胺类抗生素的细菌的存在的方法。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素包括青霉素类、单胺菌素类、头孢菌素类和碳青霉烯类，是通过抑制肽聚糖的合成起作用的抗生素。这些是在一般实践和医院医学中通常用于严重感染的一线治疗的分子。β-内酰胺酶是水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环的酶。这是耐受β-内酰胺类抗生素的最常见机制。根据Ambler(Ambler,R.P.Philos.Trans.R.Soc.LondonSerB,1980,289,321-331)，β-内酰胺酶被分为4类：A：青霉素酶，包括超广谱β-内酰胺酶(ESBL)B：金属酶C：头孢菌素酶D：苯唑西林酶在肠道细菌中，超广谱β-内酰胺酶(下文中称为ESBL)或高产头孢菌素酶的产生是目前耐受第三代头孢菌素类(下文中称为C3G)，如作为氧基亚氨基-头孢菌素类的头孢噻肟、头孢曲松或头孢他啶的主要机制。作为唯一的第四代头孢菌素(下文中称为C4G)，头孢吡肟被ESBL水解，但是通常不被头孢菌素酶水解。青霉素类也被水解，但碳青霉烯类不被水解。ESBL的活性可以被克拉维酸、他唑巴坦或舒巴坦(青霉素酶抑制剂)抑制。头孢菌素酶的活性可以被氯唑西林抑制。碳青霉烯酶(根据Ambler可以属于A、B和D类的酶)是水解碳青霉烯类、但通常也水解青霉素类和头孢菌素类的酶。快速、准确地检测耐受第三代头孢菌素类、是ESBL的或高产头孢菌素酶的或碳青霉烯酶的产生者的细菌对患者管理至关重要。其应使合适的抗生素治疗建立。在不存在产生酶的情况下，该酶水解C3G，后者可以用于一线治疗，否则将必须求助于碳青霉烯类。在这种情况下，还必须确定这些细菌是否产生碳青霉烯酶。目前，用于检测产β-内酰胺酶细菌的常规技术基于抗菌谱的实施和双纸片协同试验的应用，其能够证明在青霉素酶抑制剂的存在下对C3G的敏感性的恢复。不考虑其功效，实施该技术需要培养和分离细菌的预备步骤，这意味着在β-内酰胺酶的产生可检测之前延迟至少24小时。产β-内酰胺酶的细菌的存在还可以通过分子生物学方法来证明，例如使用PCR和/或测序来检测编码β-内酰胺酶的基因。尽管它们可以实现对编码例如ESBL的基因进行特异性表征，但是由于从复杂样品预先提取DNA而使这些实验室技术昂贵，且花费相当长的时间。因此，在医疗卫生领域中迫切需要开发一种有效、快速和廉价的方法来检测产β-内酰胺酶的细菌的存在，以检测耐受β-内酰胺类抗生素的细菌菌株的存在。Nordmann等人(J.Clin.Microbiol.,2012,50,3016-3022)描述了用于检测产ESBL细菌的方法，该方法涉及使用头孢噻肟和pH颜色指示剂。该方法基于以下事实：头孢噻肟的β-内酰胺环的水解导致形成羧酸官能团，因此导致反应介质的酸化。通过使用颜色指示剂来显现介质pH的改变。不考虑其功效和速度，该方法首先需要分离细菌菌株的限制步骤。另一种比色法包括使用头孢硝噻，其是一种显色头孢菌素，可以被所有β-内酰胺酶水解，由此使颜色从黄色变为红色(O’Callaghan等人,Antimicrob.AgentsChemother.,1972,1,283-288)。下面的图解1示出了头孢硝噻的β-内酰胺环被β-内酰胺酶水解。最近，基于相同的原理，已经提出了称为HMRZ-86的另一种显色头孢菌素(Hanaki等人,Antimicrob.AgentsChemother.,2004,53,888-889)，用于检测耐受C3G的细菌菌株。但是，这种方法再次需要使用先前分离的细菌菌株来实现比色检测。该方法不能直接用在具有可能干扰头孢硝噻水解的比色检测的着色的复杂样品上。再者，这种方法涉及在取临床样品与递送结果之间至少24小时的延迟。近年来，也已经提出了MALDI-TOF质谱法技术，用于在产β-内酰胺酶菌株的存在下在孵育β-内酰胺类抗生素后检测其水解产物(Hrabák等人J.Clin.Microbiol.2011,49,3222-3227；Sparbier等人,J.Clin.Microbiol.,2012,50,927-937)。但是，这种实验室技术也必须用预先分离的菌株来实施，仍然是昂贵的，并且需要有资格的人员来解析质谱。此外，等人(ElectrochemistryCommunication38(2014)131-133)拥有电流型生物传感器，其通过对与青霉素G被青霉素酶水解成青霉噻唑酸相关的介质的pH改变的安培测量来检测青霉素G。由于青霉素G和青霉噻唑酸不是电活性的，在起氧化还原介体作用的钴的存在下进行安培测量。Chen等人(Int.J.Electrochem.Sci.,7(2012)7948-7959)描述了在黑暗中在70℃下加热头孢氨苄的无氧碱性溶液之后实现其水解后电化学检测头孢氨苄的方法。该文献中描述的头孢氨苄的水解产物(β-内酰胺环的C-C＝O键断裂)在非常特殊的极端环境下产生，并且不能通过用β-内酰胺酶孵育头孢氨苄来获得，在这种情况下在酰胺键的水平下裂解β-内酰胺环。迄今为止，现有技术没有描述具有电活性性质的β-内酰胺酶的任何底物或具有电活性性质的由β-内酰胺酶水解所获得的任何产物。现在，本专利技术人已经发现，某些β-内酰胺酶的底物和/或它们被β-内酰胺酶水解的产物具有电活性性质。
技术实现思路
因此，在本文中，本专利技术的目的是提供一种电化学方法，该方法能够在不预先分离细菌菌株的情况下快速和有效地测定样品中产β-内酰胺酶的细菌的存在。本专利技术涉及用于体外测定可能含有产β-内酰胺酶的细菌的样品中所述细菌的存在的方法，其包括以下步骤：(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物，特别是作为β-内酰胺酶的底物的具有电化学特性的β-内酰胺抗生素，更特别是头孢菌素的培养基中孵育所述样品，(b)应用电化学分析手段以确定产β-内酰胺酶的细菌的存在。本专利技术基于如下事实：β-内酰胺酶的某些底物可以在它们已经被β-内酰胺酶水解后以电化学方法检测。特别地，可以以电化学方法检测β-内酰胺酶对β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环的水解。在本专利技术的上下文中，具有电化学特性的β-内酰胺抗生素特别是头孢菌素，更特别为头孢硝噻或化合物HMRZ-86((6R,7R)-7-[[2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-[(1-羧基-1-甲基乙氧基)亚氨基]乙酰基]氨基]-1-氮杂-3-[2-(2,4-二硝基苯基)乙烯基]-8-氧代-5-硫杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸三氟乙酸酯的E异构体)。在本专利技术的上下文中，这样的具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物还可以是由Bio-rad销售的βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)。头孢硝噻可以被所有类型的β-内酰胺酶水解，而化合物HMRZ-86只能被耐受C3G，即产生ESBL、高产头孢菌素类和碳青霉烯酶的细菌降解。βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)只被产碳青霉烯酶的细菌水解。本专利技术人已经首次证明，β-内酰胺酶的某些底物，特别是某些β-内酰胺类抗生素，如头孢硝噻或化合物HMRZ-86的电化学特性与这些水解的底物的电化学特性截然不同。例如，水解的头孢硝噻是能够产生特定的阳极氧化电流的电活性产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外确定可能含有产β‑内酰胺酶的细菌的样品中所述细菌的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在含有具有电化学特性的β‑内酰胺酶的底物，特别是作为β‑内酰胺酶的底物的具有电化学特性的β‑内酰胺抗生素，更特别是头孢菌素的培养基中孵育所述样品，(b)应用电化学分析手段以确定产β‑内酰胺酶的细菌的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.03 FR 15529281.一种体外确定可能含有产β-内酰胺酶的细菌的样品中所述细菌的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物，特别是作为β-内酰胺酶的底物的具有电化学特性的β-内酰胺抗生素，更特别是头孢菌素的培养基中孵育所述样品，(b)应用电化学分析手段以确定产β-内酰胺酶的细菌的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述电化学分析手段是电位测量、阻抗测量、电量测量或安培测量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述β-内酰胺酶的底物是β-内酰胺抗生素，特别选自包含头孢硝噻、化合物HMRZ-86((6R,7R)-7-[[2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-[(1-羧基-1-甲基乙氧基)亚氨基]乙酰基]氨基]-1-氮杂-3-[2-(2,4-二硝基苯基)乙烯基]-8-氧代-5-硫杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸三氟乙酸酯的E异构体)、或βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)的组。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物，特别是β-内酰胺抗生素的培养基中孵育可能含有所述细菌的样品，(b)分别对在步骤(a)结束时获得的前述培养基和阴性对照应用安培测量，(c)通过比较所测得的在步骤(a)结束时获得的前述培养基的对应于水解的底物，特别是水解的β-内酰胺抗生素的氧化的阳极电流的强度值和所测得的阴性对照的阳极电流的强度值来确定产β-内酰胺酶的细菌的存在。5.根据权利要求4所述的方法，为了确定可能含有产β-内酰胺酶的细菌的样品中的所述细菌和对其定量，所述方法在步骤(c)之后另外包含步骤(d)，所述步骤(d)包括比较所测得的在步骤(a)结束时获得的所述培养基的阳极电流强度值和相同条件下建立的校准曲线。6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，除了能够区分可能含有β-内酰胺酶的样品中由前述细菌产生的β-内酰胺酶的类型，且所述β-内酰胺酶的类型选自青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶、诱导型头孢菌素酶、高产头孢菌素酶和碳青霉烯酶之外，所述方法包括以下步骤：(a)在培养基A、培养基B和培养基C中平行孵育前述样品的一部分：-培养基A是基础培养基，-培养基B是补充有第三代头孢菌素的基础培养基，且-培养基C是补充有头孢菌素和青霉素酶抑制剂的基础培养基，以及任选地在培养基B’、培养基C’、培养基D、培养基E中平行培养前述样品的一部分：-培养基B’是补充有不同于培养基B中存在的第三代头孢菌素的第三代头孢菌素的基础培养基；-培养基C’是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B’；-培养基D是补充有头孢菌素和头孢菌素酶抑制剂的基础培养基，且-培养基E是补充有碳青霉烯的基础培养基，(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)中的孵育结束时获得的前述培养基；(c)对在步骤(b)结束时获得的前述培养基应用电化学手段，特别是安培测量手段，以确定产β-内酰胺酶的细菌的存在和区分β-内酰胺酶的类型。7.根据权利要求6所述的方法，为了确定产生超广谱β-内酰胺酶的细菌的存在，所述方法包括以下步骤：(a)在根据权利要求6所定义的培养基A、培养基B和培养基C中以及任选地在培养基B’和培养基C’中平行孵育前述样品的一部分，(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的孵育结束时获得的前述培养基，(c)向在步骤(b)结束时获得的前述培养基应用电化学手段，特别是安培测量手段，以确定产生超广谱β-内酰胺酶的细菌的存在。8.根据权利要求6所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：米里耶勒·德凯尔罗什莱，阿兰·哈特曼，卡特琳·诺伊维尔特，伯努瓦·尚特梅斯，
申请(专利权)人：第戎大学，第戎大学地区中心医院，国家农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：法国,FR