一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质制造技术

本发明专利技术属于食品微生物技术领域，具体涉及一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其具体经保存液的配制、基质预处理、混悬液的配制、标准物质的制备及菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得含菌数为100~350 CFU/瓶的成品。所得含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质具有良好的均匀性，可解决现有标准物质中鱼肉基质难溶于水的问题，且其品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

A standard parahaemolyticus parahaemolyticus containing fish matrix

The invention belongs to the technical field of food microbiology, Vibrio parahaemolyticus standard material and particularly relates to a matrix containing fish, its preparation, the matrix pretreatment and preservation liquid mixed preparation, preparation and identification, validation, uniform standard material value and stability test of suspension, prepared with the number of bacteria was 100~350 CFU/ finished bottle. The certified reference material of Vibrio parahaemolyticus containing fish matrix has good uniformity. It can solve the problem that fish matrix is difficult to dissolve in water in the existing standard substance, and its quality is stable and its quality is controllable. It is suitable for effective and accurate quantitative detection of microorganisms.

【技术实现步骤摘要】
一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质
本专利技术属于食品微生物
，具体涉及一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质。
技术介绍
菌种标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，通过使用菌种标准物质能够有效保证微生物定量检测高效、准确地运行，但目前国内仅在出入境检验检疫系统内少数几个局在研制，大部分的标准物质都是靠国外引进。2006年，辽宁出入境检验检疫局所研制的食品中微生物菌落总数标准物质被批准为国家二级标准物质。该标准物质包含两种研制方法：一种是以模拟食品实物，添加肠杆菌、沙雷氏菌、芽孢杆菌等具有标准号、可溯源性的菌株经冷冻干燥制成的：另一种是以鱼粉为基质与上述细菌混合经冷冻干燥制成的，而我国在食品基质的食源性致病微生物标准物质领域仍是空白，因此研制添加基质的微生物定量标准物质有重要意义。副溶血性弧菌广泛分布在沿海和海水中，此菌主要感染水产品，是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。食用感染水产品的易感者男女老幼均可患病引起胃肠炎爆发，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。本病多发生于夏秋沿海地区，常造成集体发病。近年来沿海地区发病有增多的趋势。潜伏期自1小时至4天不等。临床上以急性起病腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，严重者可出现全身痉挛甚至急性肾功能衰竭。在日本、东南亚、美国及我国台湾地区皆多见。本专利技术以副溶血性弧菌为目标菌，通过添加无菌鱼肉粉，配合冻干保护剂，经冷冻干燥、不确定度评估以及对特性值进行均匀性检测和稳定性追踪，得到含一定菌数的含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，并形成了一套食品基质的食源性致病微生物标准物质的制备工艺。专利
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其具有良好的均匀性，且品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其制备方法包括以下步骤：1)保存液的配制：将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3％氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于36±1℃培养8～18h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1℃恒温培养18～24h；然后挑取单菌落接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃培养8～18h；吸取500μL菌液于无菌离心管中，加入500μL质量浓度为40％的无菌甘油，混合，制成保存液；2)基质预处理：鱼肉剔除脂肪组织和筋，冷冻干燥后脱水率为76％。然后将脱水鱼肉粉碎至组织细度为50目，采用60Coγ辐射灭菌后分装备用；3)混悬液的配制：按1g鱼肉基质加入9mL无菌水的比例，将预处理后的鱼肉基质与水混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液；4)标准物质的制备：取步骤1)制备的保存液20μL加于200mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中36±1℃下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的OD600nm值，当OD600nm为0.335±0.1时停止培养，得新鲜菌液，然后将新鲜菌液按混悬液体积浓度0.01％加入到步骤3)制得的混悬液中，于恒温振荡器上300r/min摇匀30min，再按2mL/瓶进行分装，其含菌量为4.5×104～6.1×104CFU/mL，最后经冷冻干燥，制得标准物质；5)检验：将所得标准物质进行菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得成品。步骤1)所得保存液的平均菌数为5.3×108CFU/mL。步骤2)所用鱼肉需先经检测不含抗生素；所用60Coγ的辐射剂量为6KGY。步骤3)所述保护剂是将脱脂乳、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和水按体积比6:10:1:3混合而成。步骤4)经冷冻干燥后所得标准物质中含菌量为100～350CFU/瓶。本专利技术的显著优点在于：目前含基质的标准物质都存在一个重要的问题，即基质难溶于水，这使得标准物质难以达到满意的均匀性。本专利技术通过在预处理过程中将鱼肉基质冷冻干燥、粉碎，使所得标准物质能达到良好的均匀性。同时，本专利技术所得含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。附图说明图1冻干样品的稳定性下降率的曲线图。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。1材料与方法1.1材料与试剂菌源：副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus，VP)，ATCC17802，购自上海汉尼生物技术有限公司。基质：龙利鱼肉，购自沃尔玛超市，-20℃存储备用。试剂：3％氯化钠碱性蛋白胨水，弧菌显色培养基，3％氯化钠三糖铁琼脂，平板计数琼脂，购自北京陆桥有限公司。海藻糖(分析纯)，北京兰博利德生物技术有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸(优级纯)，上海百赛生物技术有限公司；谷氨酸钠(优级纯)，山东西亚化学工业有限公司；德运脱脂牛奶，富祺仕贸易(上海)有限公司。1.2仪器与设备KD-TBC-300M电子天平，福建科迪技术有限公司；MODULYO-4K冷冻干燥机(配有真空泵)，美国edword公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；M37610-33振荡器，金华雷琪实验器材有限公司；Stomacher3500拍击式均质器，英国SEWARD；SpectraMaxM5多功能酶标仪，MolecularDevices公司；SHKE4450台式恒温振荡器，美国Thermo公司；VXE380超低温冰箱，JOUAN/德国公司；Vitek2COMPACT30微生物鉴定仪(配套GP鉴定卡)生物梅里埃公司；BOX389微生物鉴定仪配套麦氏比浊仪，HACHCOMPANY公司；5mL西林瓶(配套丁基胶塞)，安徽华欣药用玻璃制品有限公司。1.3方法1.3.1制备保存液将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3％氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于36±1℃培养8～18h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1℃恒温培养18～24h；然后挑取单菌落接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃培养8～18h；吸取500μL菌液于无菌离心管中，加入500μL质量浓度为40％的无菌甘油，混合，制成保存液。1.3.2菌液OD600值对应的菌数范围加保存液20μL于200mL3％氯化钠碱性蛋白胨水，设计4个平行，(36±1)℃培养6、7、8、9、10、11、12、15、16、17、18、20、22h，利用多功能酶标仪测定培养液的OD600nm值，同时按照GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行菌落计数。1.3.3基质的前处理鱼肉(无抗生素残留)剔除脂肪组织(因动物脂肪较易氧化酸败，使得干粉质量下降，保存状态不稳定，因此尽量剔除脂肪)，冷冻干燥后脱水率为76.23％；将脱水鸡肉用高速万能粉碎机粉碎，至基质组织细度为50目，其呈疏松粉末状，易分散于热水中，有少量的沉淀，60Coγ辐射剂量选择6KGY，灭菌后按100g/袋分装于自封袋中，于玻璃干燥锅中存储待用。1.3.4保护剂的设计选择脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、酪氨酸、谷氨酸，分别记作M、P、T、L、G。五种因素分别设计3个水平，以存活率作为指标，进行单因素实验，筛选出3种存活率较高的保护剂脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、海本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：1）保存液的配制：将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3%氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于36±1 ℃培养8～18 h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1 ℃恒温培养18～24 h；然后挑取单菌落接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1 ℃培养8～18 h；吸取500 μL菌液于无菌离心管中，加入500 μL质量浓度为40%的无菌甘油，混合，制成保存液；2）基质预处理：鱼肉剔除脂肪组织和筋，冷冻干燥后脱水率为76%。然后将脱水鱼肉粉碎至组织细度为50目，采用

【技术特征摘要】
1.一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：1）保存液的配制：将副溶血性弧菌标准菌株冻干粉用3%氯化钠碱性蛋白胨水溶解后于36±1℃培养8～18h，后于弧菌显色培养基平板上划线分离，在36±1℃恒温培养18～24h；然后挑取单菌落接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃培养8～18h；吸取500μL菌液于无菌离心管中，加入500μL质量浓度为40%的无菌甘油，混合，制成保存液；2）基质预处理：鱼肉剔除脂肪组织和筋，冷冻干燥后脱水率为76%。然后将脱水鱼肉粉碎至组织细度为50目，采用60Coγ辐射灭菌后分装备用；3）混悬液的配制：按1g鱼肉基质加入9mL无菌水的比例，将预处理后的鱼肉基质与水混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液；4）标准物质的制备：取步骤1）制备的保存液20μL加于200mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中36±1℃下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的OD600nm值，当OD600nm为0.335±...

【专利技术属性】
技术研发人员：林杰，柯璐，郑晶，陈彬，蔡妮娜，徐珊，彭华毅，张温玲，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35