乳酸菌的筛选方法技术

本发明专利技术提供一种乳酸菌的筛选方法，其能够精度良好地评价乳酸菌产生抗菌物质的产生能力、能够探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌。在容器(1)内将倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基(2)固化之后，层叠添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基(3)并使其固化，在此状态下进行规定时间的培养。由乳酸菌产生的乳酸被中和剂中和，倾注平板琼脂培养基(2)的乳酸浓度的上升得到抑制，因此抑制了因pH降低所导致的乳酸菌的增殖阻碍。由于不阻碍乳酸菌集落的生长，因而能够精度良好地评价抗菌物质的产生能力。

Screening methods of lactic acid bacteria

【技术实现步骤摘要】
乳酸菌的筛选方法
本专利技术涉及乳酸菌的筛选方法，特别是涉及用于探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌的筛选方法。
技术介绍
细菌素(bacteriocin)是乳酸菌等细菌类所产生的具有抗菌活性的肽或蛋白的总称(例如参照日本特开2011-41474号公报)。细菌素中，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.Lactis)的一部分菌株所产生的乳酸链球菌素(nisin)在世界约50个国家以上作为食品添加物被使用。为了在工业上廉价地生产乳酸链球菌素，需要将培养液中的乳酸链球菌素浓度提高至极限，但当在产生乳酸链球菌素的乳酸乳球菌(L.lactis)中、培养液中的乳酸链球菌素浓度提高至一定值时，可见更多乳酸链球菌素的产生受到抑制的天花板现象，在乳酸链球菌素的高效率生产中成为问题。因此，期待获得通过暴露于高浓度乳酸链球菌素所导致的自然突变或UV照射等的突变处理，即便是在高浓度的乳酸链球菌素存在下也不会发生乳酸链球菌素的产生抑制的乳酸链球菌素产生株。作为确认L.lactis的乳酸链球菌素产生量的方法，已知微生物学的定量法(通过对乳酸链球菌素敏感性菌的抑菌环的大小进行评价)或液相色谱质量分析法(LC/MS法)，其中分析操作简单的微生物学定量法在基础研究领域中被广泛采用。但是，微生物学的定量法是对培养液中的乳酸链球菌素量进行定量的方法，为了评价菌株水平的乳酸链球菌素产生能力，需要对各个菌株制备培养液，包括之后的定量分析，因此需要大量的劳动力和时间。因此，作为一齐评价菌株水平的乳酸链球菌素产生能力的方法，考虑了将乳酸链球菌素敏感性菌和乳酸链球菌素产生菌进行倾注平板培养的方法(琼脂培养基倾注平板法)、或者利用在敏感性菌倾注平板培养基上表面涂抹乳酸链球菌素产生菌的方法(琼脂培养基表面涂抹法)形成集落，利用在集落周边出现的抑菌环的大小对乳酸链球菌素产生能力进行评价的方法。但是，在使用了琼脂培养基的培养中，存在由于乳酸菌自身所产生的乳酸的浓度增加而受到增殖阻碍，集落的生长停止、无法进行具有妥当性的评价的问题。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供能够精度良好地评价乳酸菌产生的抗菌物质的产生能力、能够探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌的筛选方法。本专利技术的乳酸菌的筛选方法的特征在于，在倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基上层叠添加有对乳酸进行中和的中和剂的中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环大小选择乳酸菌。或者，还可以按顺序层叠添加了对乳酸进行中和的中和剂的第1中和剂添加琼脂培养基、倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基、和添加有对乳酸进行中和的中和剂的第2中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环大小选择乳酸菌。或者，还可以在倾注平板培养有对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基上涂抹乳酸菌的培养液，在涂抹该培养液之后的倾注平板琼脂培养基上隔着膜过滤器层叠添加了对乳酸进行中和的中和剂的中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环大小选择乳酸菌。根据本专利技术，可以提供能够精度良好地评价乳酸菌产生抗菌物质的产生能力、能够探索抗菌物质的产生能力高的乳酸菌的筛选方法。附图说明图1为表示第1实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。图2为表示第2实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。图3为表示第3实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。具体实施方式本专利技术的乳酸菌的筛选方法使用摄取了对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的琼脂培养基，利用倾注平板培养法或平板涂抹培养法对含有从多个菌株或同一菌株分裂、增殖的菌的乳酸菌的培养液进行培养，根据在出现的集落周围所形成的抑菌环大小，对特定抗菌物质的产生能力高的乳酸菌进行选择。但是，当乳酸菌产生的乳酸的浓度上升、培养基的pH降低时，则会阻碍乳酸菌的集落的生长、无法正确地评价特定抗菌物质的产生能力。另外，为了防止pH降低，还已知在琼脂培养基中作为中和剂添加碳酸钙的方法，但由于碳酸钙是不溶性的、琼脂培养基发生白浊，因而无法观察到抑菌环。因此，本专利技术中，通过将倾注平板培养有乳酸菌的琼脂培养基或涂抹有乳酸菌的琼脂培养基与添加有对乳酸进行中和的中和剂的琼脂培养基层叠，在此状态下对乳酸菌进行培养，利用中和剂对伴随乳酸菌增殖所产生的乳酸进行中和，抑制因pH降低所导致的增殖阻碍。之后，通过将层叠的、含有中和剂的琼脂培养基除去，从而兼顾了pH的维持和抑菌环的观察。作为本专利技术的实施方式，根据乳酸菌的培养方法及添加有中和剂的琼脂培养基的层叠方法的不同，可以示例出以下的第1～第3实施方式。(第1实施方式)图1为表示第1实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。本实施方式中，如图1所示，在容器1内使倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基2固化之后，层叠添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基3并使其固化，在此状态下进行规定时间的培养。当伴随着乳酸菌的增殖、倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度升高时，由于倾注平板琼脂培养基2与中和剂添加琼脂培养基3的乳酸浓度的差异，乳酸向中和剂添加琼脂培养基3移动，从而被中和剂中和。由此，保持了与中和剂添加琼脂培养基3的乳酸浓度差，其结果，倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度的上升得到抑制，因而抑制了因pH降低所导致的乳酸菌的增殖阻碍。(第2实施方式)图2是表示第2实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。本实施方式中，如图2所示，在容器1内使添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基4固化之后，使倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基2固化，在此基础上进一步使添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基4固化，在此状态下进行规定时间的培养。即，本实施方式中，以2层中和剂添加琼脂培养基3及4夹持倾注平板琼脂培养基2的状态进行培养。在本实施方式的筛选方法中，当伴随着乳酸菌的增殖、倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度升高时，倾注平板琼脂培养基2内的乳酸也向中和剂添加琼脂培养基3及4移动，从而被中和剂中和。其结果，由于倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度的上升得到抑制，因而抑制了因pH降低所导致的乳酸菌的增殖阻碍。本实施方式的筛选方法中，由于倾注平板琼脂培养基2被2层的中和剂添加琼脂培养基3及4夹持，因而与第1实施方式相比，乳酸的中和迅速地进行，可以更有效地抑制乳酸浓度(pH降低)。(第3实施方式)图3为表示第3实施方式的乳酸菌的筛选方法的概略截面图。本实施方式中，如图3所示，在容器1内将倾注平板培养有对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基2固化之后，使用细菌涂布棒等将乳酸菌的培养液涂抹在已经固化的倾注平板琼脂培养基2的表面上。利用膜过滤器5将涂抹有乳酸菌培养液的倾注平板琼脂培养基2表面覆盖之后，将添加有中和剂的中和剂添加琼脂培养基3层叠并使其固化，在此状态下进行规定时间的培养。本实施方式的筛选方法中，当伴随着乳酸菌的增殖、倾注平板琼脂培养基2的乳酸浓度升高时，倾注平板琼脂培养基2内的乳酸通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸菌的筛选方法，其特征在于，在倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基上层叠添加有对乳酸进行中和的中和剂的中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在所述倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环的大小选择乳酸菌。

【技术特征摘要】
2016.08.23 JP 2016-162760;2016.09.26 JP 2016-186961.一种乳酸菌的筛选方法，其特征在于，在倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基上层叠添加有对乳酸进行中和的中和剂的中和剂添加琼脂培养基，在此状态下进行培养，根据在所述倾注平板琼脂培养基中出现的集落周边所形成的抑菌环的大小选择乳酸菌。2.一种乳酸菌的筛选方法，其特征在于，按顺序层叠添加了对乳酸进行中和的中和剂的第1中和剂添加琼脂培养基、倾注平板培养有乳酸菌和对特定抗菌物质具有敏感性的敏感性菌的倾注平板琼脂培养基、...

【专利技术属性】
技术研发人员：大岛悟，片仓启雄，山崎思乃，
申请(专利权)人：株式会社明治，学校法人关西大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP