一种血培养阴性瓶真菌检测方法技术

一种血培养阴性瓶真菌检测方法，其特征是：包括以下步骤：第一步，取待检测的血培养瓶瓶塞经过酒精灯火焰消毒，湿片压片及革兰染色载玻片需要同时酒精灯火焰消毒，第二步，使用5ml注射器抽取血培养阴性瓶中的培养物，首先每个培养基滴加5滴，然后滴1滴至载玻片预备湿片压片，再滴1滴加到另一载玻片上随即用针尖涂匀至1cm

【技术实现步骤摘要】
一种血培养阴性瓶真菌检测方法
本专利技术涉及医学微生物检验领域，尤其涉及一种血培养阴性瓶真菌检测方法二、
技术介绍
真菌在正常人的皮肤、口腔、呼吸道、肠道、阴道等均可分离到，多为念珠菌，属正常菌群或条件致病菌。真菌在我们的一些口腔、呼吸道、鼻咽部黏膜存在、生长、繁殖，但是它并没有引起我们的疾病，我们都叫做真菌的定植。当我们的机体免疫功能下降或者我们的黏膜屏障破坏了或者是有菌群的这种失调，真菌就趁势进入我们血液，进入我们组织要引起感染。真菌在血液中的定植文献中没有提及。真菌病可根据真菌侵犯部位的不同而分为浅部真菌病和侵袭性真菌病。侵袭性真菌病(invasivefungaldisease，IFD)系指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的疾病。IFD缺乏明显的临床特征，微生物、病理、影像学等现有的技术不能提供及时的诊断证据，致使多数病例尸体解剖时才被发现,郝飞教授提供1971年-2000年国内西南医院尸解资料，曲霉菌检出54.84%。75%的真菌感染在患者死亡前尚未得到证实，血液系统恶性肿瘤病人曲霉菌病可达30%，烟曲霉是血液系统肿瘤患者的主要病原体。有报道两所医科大学在1975年~1984年间白血病尸检中发现的深部真菌感染率，分别在43.7%~53%，死亡率50%~100%。1992年Bodey等统计4096例恶性肿瘤尸检中有25%的白血病患者及12%的淋巴瘤患者有深部真菌感染而生前未做出诊断。念珠菌和曲霉菌是IFD最主要的两种致病菌。IFD伴随着较高的病死率，国外数据显示念珠菌病的病死率为39％，曲霉菌病的病死率为49．3％。近年来，广谱抗生素的使用、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂、留置导管、手术、辅助通气、放化疗等。这些医源性因素一方面使病人的免疫力受到抑制或打击，一方面提供了真菌侵人体内的途径，导致侵袭性真菌感染的发生，建立人工气道进行机械通气等侵入性操作是侵袭性真菌感染的重要危险因素之一。危重病病人其特点为多伴有糖尿病、高血压、肿瘤、血液病等多种疾病，有些为重大手术或刨伤以后，机体免疫力普遍低下，加上长期使用广谱抗生素，使体内正常菌群的生态平衡遭到破坏，且大都进行了侵袭性操作(如深静脉置管、留置导尿等)，有的还使用了较长时间的全胃肠外营养、机械通气、激素治疗等。另外，危重病病人临床病情错综多变，真菌感染的临床表现不典型，在积极治疗原发病时，不合理地应用抗生素难以避免，使真菌感染有机可乘，加上真菌检测结果的假阴性率较高，更加误导了抗生素的应用，这已成为危重病病人继发真菌感染的不容忽视的一大特点。由于真菌感染症状的非特异性和临床表现的多样性，给诊断带来很大的困难。目前还没有明确的诊断标准，并缺乏标准的血清学诊断方法。现行的诊断方法伴随真菌性疾病发生率逐年增多，逐渐认识到许多真菌诊断的重要进展。真菌实验室诊断方法包括经典真菌学方法（标本采集与处理、组织病理、直接镜检、培养及鉴定、生理生化方法）和其它非培养方法（血清学、分子生物学）。直接镜检的方法，找到菌丝和孢子，以供初步诊断一种检查方法。直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法，优点在于简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，直接镜检有助于实验室选择合适的方法培养临床标本和解释培养结果。临床诊断侵袭性真菌病（IFD），直接检查(细胞学、直接镜检或培养)作为1项微生物学标准。临床检测送检标本无菌体液少、污染多合格率低，镜检方法多样、标准不统一，染色过程真菌孢子容易被洗脱掉，镜检阳性率低，培养要求条件高，普通实验室无法完成真菌培养，造成真菌检测结果的假阴性率升高，给诊断和治疗带来诸多困难，本属于侵袭性真菌病容易误诊为其它疑难杂症，贻误患者的治疗，甚至影响到患者的生命。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对
技术介绍
的不足，提供一种检查真菌存在最快速有效和廉价的真菌感染诊断方法：血培养阴性瓶湿片压片直接镜检及革兰染色镜检，能够有效解决传统送检标本检出率低的不足。血培养阴性瓶为无菌培养标本，标本来源广泛，避免二次采样，极少受到污染，血培养阴性瓶湿片压片直接镜检分生孢子阳性率80%以上，革兰染色镜检分生孢子阳性率50%以上，远远高于文献报道的真菌涂片镜检9.4%。分生孢子阳性率80%以上提示真菌在人体血液中“定植”的可能性较大。血培养阴性瓶可用于开展人体血液真菌孢子计数（如血常规）。血培养阴性瓶湿片压片直接镜检分生孢子，能够显著提高侵袭性真菌感染诊断，为临床治疗提供可靠的依据。本专利技术检测方法简单可靠、快速准确，能够被所有开展血培养的医疗单位接受推广，现有的设备、耗材能够满足试验的要求。本专利技术的另一目的是提供血培养阴性瓶真菌培养方法，能够有效解决传统送检标本培养检出率低的不足。培养基放置温度18°C-28°C、密封培养、保持湿度。血培养阴性瓶培养真菌阳性率10%以上，真菌全部为霉菌，启示真菌在人体血液中“定植”的是霉菌的可能性较大，为临床用药治疗提供明确方向。本专利技术培养方法简单易行，易于推广应用。本专利技术的最大优点是血培养阴性瓶可以实现外送检验，由专业检验机构集中检测，节约大量实验室人力物力，弥补医疗单位实验室检验人员、设备、用房投入不足的困境，降低镜检过程对人及环境污染，降低培养过程对培养基的污染及培养物对人、环境污染及交叉污染。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种血培养阴性瓶真菌检测方法，其特征是：包括以下步骤：第一步，取待检测的血培养瓶瓶塞经过酒精灯火焰消毒，湿片压片及革兰染色载玻片需要同时酒精灯火焰消毒，第二步，使用5ml注射器抽取血培养阴性瓶中的培养物，首先每个培养基滴加5滴，然后滴1滴至载玻片预备湿片压片，再滴1滴加到另一载玻片上随即用针尖涂匀至1cm2，预备革兰染色；第三步，盖片经过酒精灯消毒后凉半分钟再覆盖，然后划线接种培养，接着镜检湿片压片，最后染色镜检，血培养阴性瓶湿片压片镜检：培养瓶、载玻片、盖玻片经过酒精灯烧烤灭菌，一次性注射器抽取需氧培养瓶培养物，1滴滴到载玻片上，盖好盖玻片，油镜镜检拍照存档。湿片压片镜检发现一种毛孢子。血培养阴性瓶湿片压片镜检分生孢子80%以上。血培养阴性瓶镜检提示真菌在人体血液中“定植”。湿片压片镜检物镜使用油镜，仔细观察孢子、菌丝形态，注意一种毛孢子与粗糙孢子、刺状孢子、棘形红细胞、皱缩红细胞、毛细胞区别，注意观察凝块、结晶、水泡等异常成分；血培养阴性瓶革兰染色镜检：载玻片经过酒精灯烧烤灭菌，一次性注射器抽取需氧培养瓶培养物，1滴滴到载玻片上涂片约1cm2，油镜镜检拍照存档。血培养阴性瓶革兰染色油镜镜检分生孢子50%以上。染色过程分生孢子容易被洗脱掉，染色镜检远低于湿片压片镜检。染色脱色容易洗脱孢子，检出率滴、造成假阴性。油镜镜检涂片区域，观察孢子形态大小、颜色深浅、折光性等。血培养阴性瓶培养：培养基选择哥伦比亚血琼脂平板、沙保弱琼脂平板、马铃薯琼脂平板、玉米淀粉琼脂平板、察氏培养基、营养琼脂平板6种培养基的4种以上，接种前培养基需室温密闭放置5—10天，排除污染细菌生长，禁止培养基干燥脱水。培养放置18°C—28°C密封培养，分别于2天、5天、7天、10天、14天、20天、28天、30天观察7次有无真菌及普通细菌生长，培养结束，血培养阴性瓶培养，真菌检出率10%以上，全部为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血培养阴性瓶真菌检测方法，其特征是：包括以下步骤：第一步，取待检测的血培养瓶瓶塞经过酒精灯火焰消毒，湿片压片及革兰染色载玻片需要同时酒精灯火焰消毒，第二步，使用5ml注射器抽取血培养阴性瓶中的培养物，首先每个培养基滴加5滴，然后滴1滴至载玻片预备湿片压片，再滴1滴加到另一载玻片上随即用针尖涂匀至1cm

【技术特征摘要】
1.一种血培养阴性瓶真菌检测方法，其特征是：包括以下步骤：第一步，取待检测的血培养瓶瓶塞经过酒精灯火焰消毒，湿片压片及革兰染色载玻片需要同时酒精灯火焰消毒，第二步，使用5ml注射器抽取血培养阴性瓶中的培养物，首先每个培养基滴加5滴，然后滴1滴至载玻片预备湿片压片，再滴1滴加到另一载玻片上随即用针尖涂匀至1cm2，预备革兰染色；第三步，盖片经过酒精灯消毒后凉半分钟再覆盖，然后划线接种培养，接着镜检湿片压片，最后染色镜检；血培养阴性瓶湿片压片镜检：培养瓶、载玻片、盖玻片经过酒精灯烧烤灭菌，一次性注射器抽取需氧培养瓶培养物，1滴滴到载玻片上，盖好盖玻片，油镜镜检拍照存档，湿片压片镜检发现一种毛孢子，血培养阴性瓶湿片压片镜检分生孢子80%以上，血培养阴性瓶镜检提示真菌在人体血液中“定植”，湿片压片镜检物镜使用油镜，仔细观察孢子、菌丝形态，注意一种毛孢子与粗糙孢子、刺状孢子、棘形红细胞、皱缩红细胞、毛细胞区别，注意观察凝块、结晶、水泡等异常成分；血培养阴性瓶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵堂，
申请(专利权)人：张贵堂，
类型：发明
国别省市：山东,37