多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种多拷贝串联肽抗生素ｈＰＡＢ的制备方法。通过分子生物学操作，将ｈＰＡＢ构建成多拷贝体，并由表达载体介导在大肠杆菌中高效表达，多拷贝体表达量占细菌总蛋白的１５～２５％。以三拷贝工程菌为例，表达量为２０％，纯化的一个三拷贝体分子经裂解可获得３个活性单体，制备效率增加了２００％。本发明专利技术公开的制备方法具有分离纯化方法简单，成本低，易于放大，产物纯度高、杀菌力强等优点，可广泛地应用于医药、食品保鲜及护肤品等领域。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术。
技术介绍
肽抗生素(peptide antibiotic)，也称抗微生物肽(antimicrobial peptide)，是一类由生物体基因编码且具有抗病原体感染功能的肽类活性物质，为机体免疫系统的重要组成部分(Fellermann K，et al.NEngl J Med..2003；348(4)361-363)。它们多由12-50个氨基酸组成，分子量小，通常带有正电荷。研究表明，肽抗生素主要通过在细菌胞膜上打孔或形成离子通道而杀菌，这种独特的抗菌机制与传统抗生素截然不同，高效而迅速，且细菌对之不易产生耐药性。此外，肽抗生素还具有广谱而高效的抗菌活性，对G+菌、G-菌、真菌、带包膜病毒、原虫及肿瘤细胞都有着不同程度的杀灭作用(Hancock RE and Scott MG.Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A，2000；97(16)8856-8861)，某些种类对临床上多种多药耐受菌的MIC仅在mg/L水平(饶贤才等，生命的化学，2001；21(5)357-359)，可与传统抗生素中活性最强者相媲美。在病原菌对传统抗生素的耐药性问题日益严重本文档来自技高网...

【技术保护点】
多拷贝串联肽抗生素ｈＰＡＢ的制备，其特征是：首先根据肽抗生素ｈＰＡＢ氨基酸序列对应的核苷酸序列设计一对ＰＣＲ引物：上游引物Ｐ１：＊＊＊下游引物Ｐ２：＊＊＊然后通过ＰＣＲ技术在ｈＰＡＢ基因的５’端依次加上核酸内切酶ＢａｍＨⅠ、ＡｖａⅢ，天冬酰胺对应的核苷酸序列，在ｈＰＡＢ基因的３’端依次加上甘氨酸对应的核苷酸序列，核酸内切酶ＰｓｔⅠ，终止密码子ＴＡＡ和核酸内切酶ＨｉｎｄⅢ。ＰＣＲ产物回收后用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将之连接到ｐＱＥ－３２表达质粒的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点上，采用酶切、核苷酸测序筛选阳性重组子。提取阳性重组子质粒，分为两份，一份用ＸｈｏⅠ＋ＡｖａⅢ双酶切后回...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡福泉，饶贤才，黎庶，胡金川，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]