一种抗菌肽VIP类似肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗菌肽VIP类似肽，抗菌肽VIP类似肽为如下氨基酸序列：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN，并提供了一种抗菌肽VIP类似肽的制备方法。抗菌肽VIP类似肽的生产工艺简单，生产成本低，抑菌能力强且抗菌谱广，极具市场前景，解决了现有技术存在的结构复杂、抗菌活力不足和抗菌谱不广的局限性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及一种抗菌肽VIP类似肽及其制备方法。
技术介绍
和谐畜牧业是我国当前畜牧业发展的主题，其重要内容之一就是动物-人-自然 的和谐，而动物健康直接关系到动物源性食品品质与安全以及环境。然而，抗生素的大量使 用甚至滥用导致病原菌耐药性菌株甚至超级细菌产生、抗生素在畜禽产品中残留以及随动 物粪尿排出污染环境等一系列严峻问题，严重影响了畜产品品质和人类健康。因此，研制安 全、高效、环保型防病保健促生长添加剂来替代抗生素已显得极为迫切。抗菌肽因其具有广 谱抗菌、耐热、无毒无药残、不易产生耐药菌株等众多的优点，其研宄开发已成为世界上研 宄抗生素新产品的前沿性课题，被认为是新型抗生素研宄的新资源和重要途径。抗菌肽VIP 具有开发为防病保健饲料添加剂的优势和潜力：（1)结构简单明确：由28个氨基酸残基组 成的直链肽；（2)具有多种生物学活性，而且活性较强：免疫调节、抗炎，对大肠杆菌、金黄 色葡萄球菌等具有较强的抑杀作用；（3)作用浓度小：由于VIP属于内源性的胃肠道激素类 抗菌肽（脑肠肽），因此，以较小的作用浓度（nmoL级）就能发挥较强的生物活性。VIP本身 具有的特性使它具有开发为高效、安全的防病保健饲料添加剂的潜力和广阔的应用前景。 然而，由于抗菌肽天然资源有限，化学合成肽类成本高，而基因工程方法大量表达 抗菌肽使之成为新兴饲料和饲料添加剂的途径更为现实，并显示出良好前景。随着对抗菌 肽构效关系、作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化，设计高效、有利于人类健康 的抗菌肽作为抗生素替代品是完全可行的。利用基因工程方法获得抗菌肽的尝试已在原核 和真核体系获得成功，但异源高效表达抗菌肽仍面临多种困难，一是抗菌肽的编码基因转 录后的mRNA较小，一般只有100?200bp，同时其表达的抗菌肽在表达细胞中也容易被降 解，很难实现抗菌肽的大量表达；二是抗菌肽具有抗菌作用，表达宿主，如细菌或酵母细胞 表达的抗菌肽会反馈性抑制宿主细胞活性，影响抗菌肽的进一步表达。由此可见，如何进一 步提高表达水平，在高表达的同时充分保持抗菌肽的生物学活性，提高基因表达产物的稳 定性，设计并表达抗菌活性更强、抗菌谱更广的抗菌肽等都是值得深入探宄的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗菌肽VIP类似肽及其制备方法，以解决现有技术存在 的结构复杂、抗菌活力不足和抗菌谱不广的局限性。 本专利技术所采用的技术方案是，一种抗菌肽VIP类似肽，抗菌肽VIP类似肽为如下氨 基酸序列： HSKAVFTKNYTRLRKGjMAVKKYLNS ILN。 本专利技术所采用的另一种技术方案是，一种抗菌肽VIP类似肽的制备方法，按照以 下步骤实施： 步骤1、抗菌肽VIP类似肽基因的合成： 根据GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、结构特征和理化性质，将D3、D8替换 为K3、K8,对其进行改良；改良后的氨基酸序列为：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN ; 将TrxA与改良抗菌肽VIP进行融合表达，在抗菌肽VIP类似肽的核苷酸序列3' 端添加终止密码子ΤΑΑ，5'端添加了肠激酶（EnterokinaSe，EK)识别序列DDDDK，以便融合 蛋白被EK切割，释放出具有N端无额外氨基酸的VIP类似肽；使用XhoI和KpnI限制性内 切酶构建重组质粒，在基因两端分别设计了与pET32a(+)XhoI和KpnI位点相同的序列，便 于双酶切； 改良后的核苷酸序列为 119bp ：GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTC ACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGC GG， 上述序列中：方框显示分别为XhoI和KpnI酶切位点；下划线标识为EK识别序列； TAA为终止密码子；黑体倾斜部分为VIP类似肽基因序列； 为了获得上述目的基因，由此设计合成了 3条引物PU P2和P3,引物扩增长度为 119bp，经测序鉴定说明已成功合成该抗菌肽基因；Pl: 5' -GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAG CAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3' ； P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3' ； P3:5' 一CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG-3' ； 上述序列Pl和P2中的方框分别表示XhoI和KpnI酶切位点； 步骤2、抗菌肽VIP类似肽重组大肠杆菌表达载体的构建和鉴定： 对重叠延伸PCR法（SOE-PCR)扩增获得的基因和pET32a(+)分别同时进行双酶 切，然后进行连接，以将目的基因构建到到表达载体上，获得的重组质粒可编码TrxA-VIP2 融合蛋白。使用双酶切连接法构建重组质粒时，按外源基因与质粒摩尔数比为3 :1的比例 进行混合，反应体系为10uL，16°C过夜，同样转化DH5a感受态细胞，经测序进行鉴定，说明 抗菌肽VIP类似肽的表达载体构建成功； 步骤3、抗菌肽VIP类似肽对大肠杆菌感受态细胞的转化及诱导表达：将融合表达 质粒 PET32-VIP2 转化 E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到 pET32-VIP2/BL21(DE3)重组菌； 重组菌接种至15mL LB培养基中过夜培养，以BL21 (DE3)和pET32a(+)为对照，按1%接种 量分别接种于30mL新鲜培养基中，吸光度A_达0. 6左右时用IPTG诱导（终浓度0. 3mmol/ L)，诱导前及诱导后4h分别测定A_，分别取适量的菌体量进行SDS-PAGE ; 步骤4、融合蛋白的纯化： 培养 pET32-VIP2/BL21 (DE3)，诱导表达 4h 后收集菌体，用 A 液（20mmol/L PBS+0. 5mol/L NaCl, ρΗ8· 0)清洗，8000r/min 离心 5min，重复清洗 1 次，再以 1:10 的比例 (V :〇D)的比例将菌体重悬于A液，超声破碎后，4°C 15000r/min离心15min，收集上清液，经 BeaverBeads?金属离子螯合磁珠进行纯化，以含500mmol/L咪挫的洗脱液洗脱，可得到纯 化后的融合蛋白TrxA-VIP2 ; 步骤5、抗菌肽VIP类似肽的释放： 为获得改良抗菌肽VIP，需用人工引入的肠激酶切割位点切割融合蛋白 TrxA_VIP2,去除担体蛋白，释放目标抗菌肽；将纯化后的融合蛋白经Sephadex G-25柱脱 盐和超滤管浓缩后进行肠激酶切割，成功释放重组表达抗菌肽VIP类似肽。 进一步的，步骤1中的抗菌肽VIP类似肽基因的PCR反应体系为：10XBuffer含 Mg2+5 μ L，dNTP 2. 5mM 4 μ L，引物 P15 μ M 10 μ L，引物 P25 μ M 0· 5 μ L，引物 P35 μ M 10 μ L， pfu 0· 5 yL ;PCR 反应条件为：94°C 预变性 5min ;94°C 30s，60本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽VIP类似肽，其特征在于，所述的抗菌肽VIP类似肽为如下氨基酸序列：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐春兰，乔想金，孟尧，陈凯，高紫阳，牛卫宁，尚晓娅，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61