本发明专利技术属于纤维素酶的应用领域。本发明专利技术提供的田螺纤维素酶，是将田螺去除外壳，将其软体组织剪成４～６个碎片；然后加入磷酸缓冲液，于低温下浸泡抽提后离心回收离心液体；浓缩去水后加入硫酸铵，过滤得到的固体。使用该田螺纤维素酶进行酶解发酵燃料乙醇，可以制得９９．８ｗｔ％的燃料乙醇。本发明专利技术首次发现了田螺具有纤维素酶活，并利用一简单的方法从田螺中提取分离得到田螺纤维素酶，与现有的用于纤维素酶解同步糖化发酵中的纤维素酶相比，其最佳酶解温度为３７℃，与酿酒酵母菌发酵温度相一致，可有效解决微生物纤维素酶解温度和酵母菌发酵温度不协调的问题，也为动物纤维素酶的应用开辟了一条新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纤维素酶的应用领域，具体地说是涉及一种田螺纤维素酶，及其用于酶解发酵燃料乙醇的方法。
技术介绍
美国《工业酶学》认为“如果乙醇工业要生存，就必须利用木质纤维素生产”。如文献1Philippidis GP，Smith TK，Wyman CE，Study of the enzymatic hydrolysis ofcellulose for production of fuel ethanol by the simultaneous saccharification andfermentation process(纤维素同步糖化发酵燃料乙醇的酶水解研究).Biotechnol.Bioeng(生物技术与生物工程)，1993，41846-853中所述，目前纤维素发酵酒精技术中比较流行的是纤维素同步糖化发酵分离的方法，这种方法解决了纤维素分步酶解的反馈抑制问题。但是这种方法所用的纤维素酶大多来源于微生物纤维素酶，其酶活最适的温度是50℃左右。而在纤维素同步糖化发酵分离的方法中，发酵乙醇用的酿酒酵母菌的最适发酵温度为35～38℃。这样，二者之间存在一定温差，很难同时充分发挥纤维素酶和酿酒酵母菌的作用。若要解决这个问题，可以采用增加纤维素酶用酶量的方法，如此一来，使纤维素酶费用增加。或是采取选育耐高温酵母菌的方法来解决此问题，也不能很好地协调酶解和发酵最适作用条件的问题。还有采用补充底物、酵母菌或纤维素酶的方法来解决此问题，虽然对发酵醪中的乙醇度有所提高，但转化率仍然偏低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的纤维素酶的酶活最适温度高于酿酒酵母菌的发酵温度的缺陷，从而提供一种最佳酶解温度为37℃，与酿酒酵母菌发酵温度相一致的田螺纤维素酶。本专利技术的另一目的在于克服现有的纤维素同步糖化发酵分离的方法中不能很好地协调酶解和发酵最适作用条件的缺陷，从而采用本专利技术提供的田螺纤维素酶，来酶解发酵燃料乙醇的方法。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的本专利技术提供一种田螺纤维素酶，其为通过如下步骤得到的1)将田螺去除外壳，将其软体组织剪成4～6个碎片；2)加入软体组织重量8～10倍的10mM的pH7.0的磷酸缓冲液，于低温(4～8℃)下搅拌浸泡抽提一个小时，然后以4000r/min的转速离心10～20分钟，回收离心液体；3)将离心液体用常规超滤方法浓缩去水30％，得到的浓缩液中再加入浓缩液重量60～80％的硫酸铵，搅拌均匀，静止10～20分钟后，过滤，得到固体的田螺纤维素酶。所述的田螺优选中华园田螺等中国分布的大型螺类，可以收集或规模化养殖。所述步骤2)中滤出的软体组织残渣可进一步加工成食品或加工成蛋白饲料。本专利技术提供一种使用上述田螺纤维素酶进行酶解发酵燃料乙醇的方法，包括如下步骤1)将纤维素原料装入同步酶解发酵反应器中，通入0.1Mpa的高压蒸汽灭菌30min，然后冷却到50℃；在无菌操作条件下，按照10～20U纤维素酶酶活/g纤维素原料的比例加入本专利技术的固体的田螺纤维素酶；所述的纤维素原料为纸浆，或是在1.5Mpa条件下保压预处理10min后的秸秆或木材等；2)在无菌条件下，向同步酶解发酵反应器中接种该反应器容积10％(V/V)的酿酒酵母液体种子液体，在35～38℃下发酵3～5天；3)发酵结束后，按常规方法蒸馏和精馏，制得99.8wt％的燃料乙醇。尽管纤维素酶是1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现的，但是过去的观点都认为，一些无脊椎动物以及高等的食草动物是通过体内共生的原生动物和细菌产生的纤维素酶来消化纤维素。随着对无脊椎动物体内纤维素酶的研究的深入，这种共生消化理论受到挑战，人们开始对动物体内的纤维素酶有新的认识。本专利技术首次发现了田螺具有纤维素酶活，并利用一简单的方法从田螺中提取分离得到田螺纤维素酶，与现有的用于纤维素酶解同步糖化发酵中的纤维素酶相比，其最佳酶解温度为37℃，与酿酒酵母菌发酵温度相一致，可有效解决微生物纤维素酶解温度和酵母菌发酵温度不协调的问题，也为动物纤维素酶的应用开辟了一条新途径。本专利技术的优点还在于(1)由于田螺是我国一种分布广、适应性、人们喜食的大型螺类，发现了田螺具有纤维素酶活，增加了廉价田螺的应用新途径；(2)建立了针对田螺纤维素酶提取分离工艺方法，田螺的纤维素酶比活力较高，降低了纤维素酶制剂的成本；(3)由于田螺纤维素酶最佳酶解温度为37℃，与酿酒酵母菌发酵温度相一致，田螺纤维素酶制剂较好地应用于纤维素酶解同步糖化发酵中，可有效解决微生物纤维素酶解温度不协调问题。具体实施例方式实施例1、制备田螺纤维素酶收集池塘中的田螺，用水洗干净后，将田螺外壳去除，然后将每个田螺的软体组织剪成4个碎片，加入软体组织重量8倍的10mM的pH 7.0的磷酸缓冲液，于4℃低温下搅拌浸泡抽提一个小时，再以4000r/min的转速离心10分钟，回收离心液体，滤出的软体组织残渣可进一步加工成食品或加工成蛋白饲料。将离心液体用常规超滤方法浓缩去水30％左右，得到的浓缩液中再加入浓缩液重量70％的硫酸铵，搅拌均匀，静止20分钟后，过滤，得到固体的田螺纤维素酶。实施例2、制备田螺纤维素酶收集规模化养殖的中华园田螺，用水洗干净后，将田螺外壳去除，然后将每个田螺的软体组织剪成5个碎片，加入软体组织重量9倍的10mM的pH7.0的磷酸缓冲液，于8℃低温下搅拌浸泡抽提一个小时，再以4000r/min的转速离心15分钟，回收离心液体，滤出的软体组织残渣可进一步加工成食品或加工成蛋白饲料。将离心液体用常规超滤方法浓缩去水30％，得到的浓缩液中再加入浓缩液重量60％的硫酸铵，搅拌均匀，静止15分钟后，过滤，得到固体的田螺纤维素酶。实施例3、制备田螺纤维素酶收集稻田中的田螺，用水洗干净后，将田螺外壳去除，然后将每个田螺的软体组织剪成6个碎片，加入软体组织重量10倍的10mM的pH 7.0的磷酸缓冲液，于6℃低温下搅拌浸泡抽提一个小时，再以4000r/min的转速离心20分钟，回收离心液体，滤出的软体组织残渣可进一步加工成食品或加工成蛋白饲料。将离心液体用常规超滤方法浓缩去水30％，得到的浓缩液中再加入浓缩液重量80％的硫酸铵，搅拌均匀，静止10分钟后，过滤，得到固体的田螺纤维素酶。实施例4、使用本专利技术的田螺纤维素酶进行酶解发酵燃料乙醇将纸浆装入同步酶解发酵反应器中，通入0.1Mpa的高压蒸汽灭菌30min，然后冷却到50℃；在无菌操作条件下，按照10U纤维素酶酶活/g纸浆的比例加入本专利技术实施例1制备的田螺纤维素酶；然后在无菌条件下，向同步酶解发酵反应器中接种该反应器容积10％(V/V)的酿酒酵母液体种子液体，在37℃下发酵4天；发酵结束后，按常规方法蒸馏和精馏，制得99.8wt％的燃料乙醇。实施例5、使用本专利技术的田螺纤维素酶进行酶解发酵燃料乙醇将在1.5Mpa条件下保压预处理了10min的秸秆装入同步酶解发酵反应器中，通入0.1Mpa的高压蒸汽灭菌30min，然后冷却到50℃；在无菌操作条件下，按照15U纤维素酶酶活/g秸秆的比例加入本专利技术实施例2制备的田螺纤维素酶；然后在无菌条件下，向同步酶解发酵反应器中接种该反应器容积10％(V/V)的酿酒酵母液体种子液体，在35℃下发酵3天；发酵结束后，按常规方法蒸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种田螺纤维素酶，其为通过如下步骤得到的： １）将田螺去除外壳，将其软体组织剪成４～６个碎片； ２）加入软体组织重量８～１０倍的１０ｍＭ的ｐＨ７．０的磷酸缓冲液，于低温下搅拌浸泡抽提一个小时，然后以４０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１０～２０分钟，回收离心液体； ３）将离心液体用常规超滤方法浓缩去水３０％，得到的浓缩液中再加入浓缩液重量６０～８０％的硫酸铵，搅拌均匀，静止１０～２０分钟后，过滤，得到固体的田螺纤维素酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈璇，马丽霞，
申请(专利权)人：北京市第一零一中学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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